几种蛋白酶的提取方法研究.doc

几种常用蛋白酶的提取方法 摘要：本文总结了几种常用蛋白酶的提取方法。这些蛋白酶的提取原材料都来自普通家常食物，提取方法易于实行，适合初学酶工程的学生进行实验。 关键字：菠萝蛋白酶 生姜蛋白酶 猕猴桃蛋白酶 提取 刚接触酶实验的学生需要常见的实验材料和简便的实验方法进行实验，以下几种蛋白酶的提取均取材于果蔬等，方法也比较简便，非常适合学生学习用。 1．菠萝蛋白酶的提取 1．1 传统吸附法提取菠萝蛋白酶 取一定量的菠萝肉，压榨得菠萝汁，加入5％NaCI溶液搅匀，4 000 r／min离心7 min，取上清液倒人干净的烧杯中．在上清液中缓缓加入0．2％的单宁溶液，边加边搅拌约l5 min，静止，用离心机进行二次离心，倒去上清液，把酶复合沉淀物倒入离心杯中，以4 000 r／min离心l0 min，倒掉上清废液，得到酶糊复合物，把提取的蛋白酶糊倒入烧杯中，加0．1％ EDTA溶液，搅匀，再把0．15％氯化钠溶液，搅匀，以4 000 r／min离心7 min，倒掉上清废液，得到酶复合沉淀物，倒入烧杯中，加0．5％ 氯化锌溶注，静止5 min，加0．06％抗坏血酸，静止l0 min；加1．5％ 氯化钠溶液，搅匀静止5 min；最后加0．5％ EDTA 溶液，静止2 h后，以4 000 r／min离心7 min，把上清液倒掉，得到酶液，以4 000 r／min离心7 min倒掉上清废液，最后得到蛋白酶糊．把酶糊倒入装有氯化钙或五氧化二磷的干燥器中干燥6～10 h，得到的是菠萝酶。 1．2 新型吸附法提取菠萝蛋白酶的过程 菠萝压榨得汁液，按压出汁液的体积量加l0％氯化钠，在室温下自然沉降l20 h，弃去沉淀物，得澄清液．将澄清液移入烧杯中，在搅拌条件下，按澄清液体积加入0．05％EDTA．2Na、0．02％维生素C，立刻加入0．1％ 的单宁和自制的吸附剂，在4 cC下静置l h，离心弃去上清液，收集沉淀物，加入2～3倍pH值为4．5的抗坏血酸溶液，静止30 min．离心l4 min，弃去沉淀物，收集滤液，用冷冻真空干燥即得菠萝酶l2 J． 2．生姜蛋白酶的提取 2．1 实验方法 生姜蛋白酶提取液制备：取定量新鲜生姜，切成小块后加入10倍体积的pH 6．0，0．2 mol／L磷酸缓冲液(4℃)，于粉碎机中匀桨，8层纱布过滤后于4000 rpm离心10 min，吸取上清液，加入高饱和度的(NH4)2SO4液使盐析体系中(NH4)2SO4终饱和度为60％，4000 rpm离心15 min。收集上层不溶物，用少量pH 7．50的柠檬酸缓冲液溶解，在4℃下对同种缓冲液透析8 h。透析液定容，即为生姜蛋白酶提取液。 2．2 生姜蛋白酶的反胶束萃取 在生姜蛋白酶提取液加入等体积的AOT-异辛烷阴离子反胶束或CTAB-庚烷／辛醇阳离子反胶束，用磁力搅拌器以200 rpm的速度进行搅拌5～10 min，8000 rpm离心10 min，萃余液(下层)用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。 3．猕猴桃蛋白酶的提取 3．1 工艺流程 猕猴桃蛋白酶的提取方法主要采用经典生物化学方法中的盐析沉淀法，配合使用等电点沉淀法。盐析时的中性盐选择食盐，精制时的有机溶剂选择乙醇，主要考虑生产出的 酶产品将主要用于食品、医药、化妆品等领域的安全性问题。其主要操作步骤见图1。 3．2 粗酶提取率 收集经固液分离后的湿酶饼，经真空干燥后所制取的猕猴桃蛋白酶干粉重量(g)，与所用果汁重量(g)的百分比即为粗酶提取率l1 。 粗酶提取率(9／6)一粗酶干粉重量(g)／N有果汁的重量(g)×100 3.3 提取过程 ①原料选择选择849成熟的猕猴桃果实，商品果、残次果均可。清除掉霉烂、软腐及青果。 ② 榨汁 挑选出的猕猴桃榨汁后用，双层粗沙布过滤，弃去固形物。 ③盐水配制 分别配制15 、17．5 、2O 、22．5 、25 及28 (饱合食盐水)不同浓度的食盐水。 ④ 粗酶的提取分别取果汁2OO mI 与不同浓度的食盐水按体积比l：l混合，不断搅拌，使果汁与盐水充分混匀；用3 mol／I 的HCl和3mol／I 的Na(_)H 调整f昆合液中的pH 分别为3．8、4．0、4．4、4．8、5．2； 置0～4℃低温条件下静置沉淀8～l2 h；真空抽滤，弃滤液；收集湿酶饼在6O C真空干燥2～3 h；球磨粉碎，过40目筛，即为猕 猴桃蛋白酶粗酶制品。 ⑤精酶制备 取上述湿酶，用75 (v／v)的乙醇溶液溶解(1 g湿酶加入约50倍体积的乙醇溶液)，充分搅拌；3 500 r／rain离心2O min；弃上清液；将沉淀复溶于乙醇溶液中，重复2～3次，收集沉淀物进行真空干燥，即得猕猴桃蛋白酶精酶制品。 结语：实验过程中，pH值对酶活力有很大的影响，大多数的酶在酸性条件下活力最强，在碱