ISSR(inter-simplesequencerepeat)分子标记的实验原理及操作流程.docVIP

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记的实验原理及操作流程 ISSR（inter-simple?sequence?repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在?3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在?SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。 关键词：标记分子ISSRinter-simplesequencerepeatSSR引物RAPD分子标记单寡聚核酸 ISSR标记 ISSR（inter-simple?sequence?repeat）标记是一种类似RAPD，但利用包含重复序列并在 3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是，ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点，利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列，由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。 ? 一、实验材料 　　不同来源的 DNA(30-50ng/ul)。? 二、实验设备? 　　PCR仪，PCR管或硅化的 0.5ml?eppendorf管，电泳装置，凝胶成像仪。? 三、试剂? 　　1、 ISSR引物：购买成品或根据加拿大British?Columbia大学设计的ISSR引物序列（见附录）自己合成。? 　　2、Taq酶 　　3、10xPCR?缓冲液 ??????? 4、MgCl2：25mmol/L。? 　　5、 dNTP：2.5mmol/L。?? 四、操作步骤：? 　　1. 在25ul反应体系中，加入? 　　　　模板DNA 1ul (30-50ng)? 　　　　ISSR引物 1ul (约5pmol)? 　　　　10xPCR Buffer 2.5ul? 　　　　MgCl2 2ul? 　　　　dNTP 2ul? 　　　　Taq酶 1单位（U）? 　　　　加ddH2O 至 25ul? 　　混匀稍离心, 加一滴（约20 ul）矿物油。? 　　2. 在PCR仪中预变性94 2分钟, 然后循环: 94 1分钟， 45-68℃ 40秒， 72 1-2分钟，共40轮循环。? 　　 3. 循环结束后, 72 10分钟，4保存。 　　4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。? 　　5. 电泳结束，溴化乙锭染色20分钟。 6. 用凝胶成像仪观察、拍照。? 操作流程简图： 注：样品可以采用新鲜样品，硅胶干燥样品，标本等???? DNA提取可采用CTAB或SDS法???? DNA质量检测可用紫外分光光度计法和电泳法附录?? UBC Primer Set #9 (Microsatellite)? 引物名称 序列 引物名称 序列 801 ATA TAT ATA TAT ATA TT 851 GTG TGT GTG TGT GTG TYG 802 ATA TAT ATA TAT ATA TG 852 TCT CTC TCT CTC TCT CRA 803 ATA TAT ATA TAT ATA TC 853 TCT CTC TCT CTC TCT CRT 804 TAT ATA TAT ATA TAT AA 854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 805 TAT ATA TAT ATA TAT AC 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 806 TAT ATA TAT ATA TAT AG 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 857 ACA CAC ACA CAC ACA CYG 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 858 TGT GTG TGT GTG TGT GRT 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 859 TGT GTG TGT GTG TGT GRC 810 GAG AGA GAG AGA GAG AT 860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 861 ACC ACC ACC ACC ACC ACC 812 GAG AGA GAG