壳聚糖对植物细胞作用的早期研究完结版.docVIP

壳聚糖对植物细胞作用的早期研究 摘要 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物，表现出抗真菌的特性，可视为植物抵抗真菌病原体的强效激发子。在这方面的研究主要是由壳聚糖导致的在链引发上的早期研究。为此本文给出了壳聚糖触发的在剂量依赖性方面含羞草活细胞膜的瞬态极化现象和相关的在枕组织培养基中触发的pH的短暂上升现象。该化合物是通过质膜H+-ATP酶对质子流和酶在250μg ml–1时的催化活性的抑制作用来实现其作用机理的，通过应用质膜囊泡这种机理被具体化了。结果壳聚糖改变了H+介质的传导过程，尤其是它抑制了以H+为共同模板的蔗糖和缬氨酸的吸收，同时还抑制了活细胞中由光引发的H+/K+介质的膨胀反应。目前的数据还允许在质膜水平上在限制细胞毒性的情况下应用接近100 μg ml–1的该化合物。因此相对于一般抗菌剂的直接作用，壳聚糖作为强效激发子在植物病的控制上有更好的效果。 引言 壳聚糖（β-1,4氨基葡萄糖）是一种在许多真菌细胞壁中找到的甲壳素脱乙酰化的产物，根据以前的报告中的数据，该化合物具有两种功能：首先在给定的浓度下，它可以表现出抗真菌的性能，它可以抑制大量致病真菌（包括根病原体如Fusarium oxysporum和Pithium phanidermatum）菌丝的生长，对孢子的萌发也有抑制作用；其次它作为一种有效的诱导剂可以提高植物对病原体的抗性。作为在不同植物细胞中植保素合成的有效引发剂，它可以引发胼胝质Ca2+、H+的流入和K+、Cl–的流出导致的离子通道的激活。在这方面，通过测量枕组织培养基中变化的pH值和通过对质膜囊泡的作用的观察证明了壳聚糖活动主要是由于质膜H+-ATP酶的作用。另外测量和观察过程还显示了在相对较高的浓度下，壳聚糖抑制了以H+为模板的离子吸收过程和由K+驱动的活细胞中的反应。这些结果是根据化合物对细胞的毒性来讨论得出的。 原料和方法 植物原料 敏感植物（M含羞草）和Cassia fasciculata Michx.都被种植在每日灌溉和有机堆肥的土壤中，在温度为27.5±0.5 °C和相对湿度为65±5%的温室中培养。为了达到16小时光照，由荧光管来调节光照（光照波段位400—700 nm，感光期为06.00–22.00 h）从而使植物顶端的光子流密度为36 μmol m–2 s–1。当这两种植物的展开叶片叶孔内径为10时刻被使用。 电生理测量 电跨膜电位用经典的电生理学的方法通过微电极（尖端直径1 μm，尖端电阻5—30 M）详细数据请参阅Moyen et al. (2007)。简言之，叶子从叶柄处切除，叶枕被固定在4 ml试管底部，管内装满成分为1 mM NaCl, 0.1 mM KCl和0.1 mM CaCl2，用10 mM MES/NaOH的缓冲溶液将pH控制在5.5。将玻璃微电极深入枕组织的远轴活性细胞中，进行32次试验测得静跨膜电位的平均值为–124±19 mV。 pH值得测定 初期枕组织[鲜重约400 mg (FW)]从枕组织上切除，横向分割，如前所述进行处理(Moyen et al. 2007)：在含0.50 mM CaCl2, 0.25 MgCl2,不含缓冲剂的培养基中用pH剂读取变化的pH值，pH剂由连有电位记录器的微型组合电极提供。本实验至少重复三次。 PMVs的准备和使用 根据Lemoine等人（1991）用萃取的方法将PMVs从初级枕组织中提取出来。质子流和ATP酶的活性如Noubahni等人所描述的进行测量并稍做修改，在培养基中加入0.05%的烷基醚乳化剂使PMVs均匀分布，在实验前十分钟加入给定浓度的壳聚糖，在495 nm处，吖啶橙吸光度下降时，质子流的变化即被检测到。在组份为50 mM KCl, 10 mM MES/TRIS (pH 6.5), 3 mM ATP, 1 mM 二硫苏糖醇，, 1 mg ml–1牛血清蛋白， 20 μM 吖啶橙, 5 mM 缬氨霉素, 300 mM 山梨醇, and 75 μg 蛋白质，最终体积为1 ml。添加MgSO4至浓度为3 mM时反应开始。PMVs的ATP酶水解活性测定是通过Ames(1996)的方法，在含有3 mM MgSO4, 100 mM KCl, 50 mM MES/TRIS (pH 6.5), 3 mM ATP, 250 mM 蔗糖, and 40 μg 蛋白质的培养基中测定由ATP释放的磷酸盐。分别经过5, 10, 15, 和 20 min, 100 μl组分被标定并和阻止反应进行的钼氨酸试剂混合。在用于这项研究的六批PMVs中，用0.25 mM钒酸钠处理的批次显示出了50-70%酶活性是由于质膜的作用。 PMVs可以如上所述用壳聚糖处理，还可以在室温下（25 °C）将其放在混合有2%多聚甲醛和0.5%戊二醛的0.1 M磷酸盐