实验九口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取.docVIP

实验 口腔脱落粘膜基因组DNA的提取 [原理] 利用煮沸法裂解口腔脱落粘膜基因组DNA溶解于上清中可取做PCR反应模板[器材] 1、1.5ml离心管 2、微量移液器 3、高速冷冻离心机 4、加热锅 [试剂] 1、PBS（137mmol/L NaCI, 2.7mmol/L KCI, 4.3mmol/L Na2HPO47H2O, 1.4mmol/L KH2PO4） 2、TE溶液 [实验步骤]： 2、10000 r/min离心3min； 3、倒掉上清液，沉淀加入100ul TE缓冲液； 4、高速振荡5-10sec，悬浮沉淀，沸水煮10min后冰浴3-5 min； 5、高速振荡5-10sec；10000/min离心3min； 6、取上清液用于扩增反应；4℃保存或冻存剩余DNA。 实验 瘦素受体基因的限制性片[原理] 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。’—CCGG—3’ 5’ —CCAG—3’ 3’ —GGCC—5’ 3’—GGTC—5’ PCR扩增产物为440bp，内切酶MspI作用后有三种结果：AA纯合子440bp，GA杂合子140bp、300bp、440bp，GG纯合子140bp和300bp，见图1。 图1 瘦素受体基因Gln223Arg多态性电泳结果 注： 7 ：DNA分子量标准 1,6 ：AA型（440bp） 2,3 ：AG型（140bp，300bp和440bp） 4,5 ：GG型（300bp和140bp） [器材] 1、DNA扩增仪 2、高速台式离心机 3、标本裂解仪（或沸水浴） 4、电泳仪 5、平板电泳槽 6、旋涡混匀器 7、紫外分析仪 8、微量进样器 9、[试剂] PCR Kit 3、限制性内切酶MspI Kit 4、电极缓冲液、琼脂糖凝胶（或聚丙烯酰胺凝胶） 、溴乙锭（1mg/100ml） [实验步骤] 一、PCR CR反应在20ul反应体系中进行，冰上操作，依次加入 10×缓冲液 .0ul 2.5uM dNTP 1ul 5umol/L 上下游引物 1.0ul TaqDNA聚合酶 1U 模板DNA（1ng-1ug） .0 ul 加ddH2O至 0ul 2、扩增条件：94℃变性3min，然后与94℃变性s，5℃退火3s，72℃延伸40s，循环35次后，72℃保持5min，扩增产物4℃保存。 1、酶切反应液的准备:在Eppendorf管中依次加入 双蒸水 μl 10×酶切缓冲液 μl PCR产物 5 μl MspI 酶液（10u/μl） 1 μl 2、将装有上述反应液的Eppendorf管于37℃水浴保温1小时。、电泳鉴定 扩增产物μl 6×载样缓冲液混匀，经1%琼脂糖凝胶（含0.5ug/ml溴电泳30分钟，电压为5V/cm。在紫外灯下观察扩增的DNA片段，鉴定待检标本中基因片段。 多态性