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实验8 影响植物原生质体融合研究 【目的】 了解和探讨黄瓜幼苗不同器官(或酵母)原生质体提取、纯化和融合的适宜条件，认识研究原生质体融合方法的重要性。 【原理】 细胞融合过程一般首先是细胞质的融合，尽管在特殊诱导物(如聚乙二醇等)的作用下，细胞膜可能会发生一定变化使两个或多个细胞发生融合。考虑用原生质体为材料进行融合，可以避免这些不利因素。 聚乙二醇诱导原生质体融合，通常用相对分子质量1000的PEG做融合剂最好，50%PEG溶液能产生最多杂交细胞,使用相对分子质量较小的PEG时,以55%浓度为好。PEG溶液在pH 6.0时细胞融合率最高,融合时细胞密度不要太大,在汇成单层之前融合时能产生更多杂种细胞。同样,要成功地用电场法融合原生质体,也依赖于植物材料的生理状况、实验条件。 黄瓜是分离原生质体的较好材料。已经有建立黄瓜子叶、真叶或胚性悬浮培养细胞获取的原生质体分离、培养体系的报道。但其原生质体融合与其品种、取材部位和培养条件等有关(也可以用酵母为材料)，方法仍需要摸索和建立。据报道，种子萌发培养的条件、苗龄以及是否黄化等因素对分离、提取原生质体有较大影响；取合适器官的细胞、用分解细胞壁酶系的浓度、酶解时间也直接影响原生质体的分离、纯化。原生质体的活力和密度是发生融合的基本条件。 【实验内容】 查阅文献,按照下面提示提出实验方案。每小组重点探讨一个过程(如萌发过程、器官培养过程、酶解细胞壁过程等)的不同因素对原生质体分离和融合的影响。 1. 选用不同的黄瓜品种的种子，不同条件下(在无菌条件下光照、不同药剂浸泡处理、种子成熟率等)进行萌发，观察萌发条件对原生质体提取、分离和纯化的影响。 2. 选择不同培养基培养黄瓜(或酵母)对分离原生质体的影响。 3. 取不同器官切成细条后提取原生质体，比较获取原生质体的条件和能力。 4. 用不同成分、浓度的酶液(含0.5%~2%纤维素酶、0.3%~10%离析酶、0~0.5%半纤维素酶、3mmol/L 2-N-吗啡琳乙磺酸钠、10mmol/L CaCl2、0.7mmol/LKH2PO4和0.3mol/L甘露醇组成的酶液)(pH5.7)分离原生质体，过滤和洗涤后离心沉淀收集原生质体。了解不同酶系对原生质体分离的影响。 5．用化学诱导法或电融合法分别融合原质体，了解使用黄瓜(或酵母)用两个方法融合的适宜条件。观察原生质体密度对原生质体融合的影响。 6．融合后原生质体短暂培养条件(从培养基、培养方式、光照条件等方面)的建立和效果比较。 7．通过显微摄影记录原生质体融合情况，或在显微镜下观察统计原生质体融合率。 【实验报告】 研究不同因素对黄瓜(或酵母)原生质体的分离和融合过程的影响，结合专业知识分析其原因，提出改进的方法。 * * *