植酸酶活性测定应注意的几个问题.docVIP

刘小春1 温度植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度低会降低它的生物活性；温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要，国标要求植酸酶活性测定时的温度为（37±0.1）。在33时植酸酶不能很好地发挥其活性，酶活与其真实值相比约低10%；在40时，部分植酸酶会失活，酶活与其真实值相比约低8%。另外，水浴加热时，水浴液面要超过试管内反应液液面，使其在规定时间内充分反应。2 pH值pH值在酶活测定时影响很大，国标要求pH值为5.5。当pH值为3.0时，植酸酶活力基本消失。尽量不要用酸度计来调节缓冲液的pH值，因为酸度计存在一定的误差，使用时间长了会发生钝化，使测定的pH值不准。可以通过计算缓冲溶液中H+浓度的方法来配制一定pH值的溶液。如：配制0.25mol/l乙酸缓冲液，加入34.02g三水乙酸钠、2.78ml浓盐酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH试纸测定溶液pH值为5.0。笔者曾用酸度计对照，配制上述pH值溶液需加入浓盐酸6ml，1：3盐酸约20ml，此溶液pH值实际上已经低于5.0，由此说明此酸度计已经反应迟钝。配制0.25mol/l、pH值5.50的乙酸缓冲液，需加入34.02g三水乙酸钠、1.24ml浓盐酸，完全溶解后定容至1 000ml，用精密pH试纸测定溶液pH值为5.50。3 底物植酸钠的型号植酸钠有两种型号，一种是Sigma p-3168，分子量为923.8；另一种是Sigma p-8810， 分子量为660.03。根据国标要求，植酸钠应为Sigma p-3168，笔者在实验中发现Sigma p-3168植酸钠底色浅，且作磷标准曲线时梯度较好（见表1、表2）。 由表1、表2可以看出检测植酸酶活性时用Sigma p-3168为反应底物较好。 4 离心速度和时间当水浴30min终止酶解反应后，需要进行离心。国标要求4 000r/min，离心10min。若以3 000r/min离心10min，则离心不彻底，测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度；以5 000r/min离心10min时，发现标准曲线各梯度的吸光度与以4 000r/min离心10min时相比偏低。如果应用国标改进法，乙酸缓冲液中加入了牛血清白蛋白，离心时间需要15min。笔者曾用国标改进法进行了时间对比实验，测定酶活时离心10min和15min后样品的吸光度（见表3）。 由表3可见，离心时间对测定结果影响很大。5 公式换算在整个实验过程中即使做得再成功，若公式换算出错，将会前功尽弃。植酸酶绝对法测定酶活时，计算公式如下：式中：C——根据实际样液的吸光值由曲线回归方程计算出的y值（U）；F——试样溶液反应前的总稀释倍数；m——试样质量（g）；30——反应时间（min）。其中F所代表的总稀释倍数换算时容易出现错误，现在我们举例说明：称取500IU植酸酶1.000 0g，用乙酸缓冲液溶解并稀释定容至100ml，从其中取出1ml继续稀释至12.5ml，稀释倍数为1 250；若称取1 000IU植酸酶 0.500 0g，用上述方法进行稀释，则稀释倍数为2 500，计算时若写成则错误，这样就多乘了2倍。应写成，这是在公式换算时应注意的问题。