09第九章高效液相色谱法.pptVIP

§9—1 概 述 液相色谱简称为LC，当采用颗粒十分细的高效固定相，并采用高压泵输送流动相，全部过程通过仪器来完成，这种新型的柱色谱，又称为高效液相色谱，简称为HPLC。 ① 与气相色谱比较，液相色谱不受样品挥发度 和热稳定性的限制，非常适合于分离生物大 分子、离子型化合物、不稳定的天然产物， 以及其它各种高分子化合物等； ② 液相色谱中的样品，同时与流动相和固定相 发生选择性的相互作用，这为控制和改善分 离条件多提供了一个因素； ③ 由于HPLC耗资较大，在实际工作中，凡能 用气相色谱分析的样品，一般不用液相色 谱法，且因GC更快、更灵敏、更方便。 §9—2 高效液相色谱仪 一、仪器工作流程： 二、高效液相色谱仪： 一 高压输液系统： 恒压泵 恒流泵 双 头 往 复 泵 单 头 往 复 泵 注 射 泵 作用：提供足够恒定的压力，使流动相以恒 定的流量通过色谱柱。 梯度洗脱： 在分离过程中，按一定的程序连续改变流动相中多种不同性质溶剂的配比，以连续改变色谱柱中流动相的极性、离子强度或酸度等,从而改善被分离组分的分离效果，缩短分析时间，使色谱峰峰形得到改善，提高测定的灵敏度和定量分析的精度。 二 进样系统： 旋转六通阀进样 三 分离系统： 色谱柱——仪器的心脏 四 检测器： 无通用检测器 蒸发光散射检测器 紫外检测器 固定波长检测器 可变波长检测器 示差折光检测器 荧光检测器 §9—3 常用高效液相色谱法介绍 一、液—固色谱： 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用范围：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试 样，对具有官能团的化合物和异构体有较 高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。 二、液－液色谱法： 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：固定液为极性，流动相为非极性的液相色 谱法称为正相液相色谱；反之，则称为反 相液相色谱。二者的出峰顺序相反； 固定相——化学键合固定相：将各种不同基团通过 化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离 羟基上。 应用： 极性化合物 非极性化合物 正相液相色谱 反相液相色谱 三、离子交换色谱法： 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分 与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电 荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。 四、凝胶色谱法： 1.原理： 基于试样中各组分分子的大小和形状不同来实现分离。 凝胶的孔穴大小与被分离组分的分子大小相当，当流动相将组分带入时，比孔穴大的分子先流出柱子，比孔穴小的分子最后流出柱子，中等大小的分子则可渗透入较大的孔穴中，但受小孔穴的排斥。 被分离组分依相对分子量从高到低的顺序流出色谱柱，即得到分离。 2.应用： 主要用于分离相对分子质量大于2000的化合物。 五、液相色谱的选择： §9—4 高效液相色谱分离类型的选择 1．高压泵将贮液器中的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出； 2．样品从进样器进入时，被流经进样器的流动相带入色谱柱中进行分离，然后依次进入检测器； 3．产生的信号用记录仪记录，即得色谱图。 * 1．高压泵将贮液器中的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出； 2．样品从进样器进入时，被流经进样器的流动相带入色谱柱中进行分离，然后依次进入检测器； 3．产生的信号用记录仪记录，即得色谱图。 *