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大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与成骨鉴定 作者：李显澎 樊粤光 刘建仁 范海蛟 江晓兵 孙志刚 曾建春 阳建权 【摘要】 【目的】研究大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离纯化和在诱导条件下的成骨能力。【方法】取SPF级SD大鼠6只，采用全骨髓贴壁培养法分离成年大鼠骨髓间充质干细胞，取传至第3代的MSCs进行细胞形态和免疫组化鉴定；应用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的诱导分化培养液诱导传代细胞向成骨细胞分化，检测碱性磷酸酶（ALP）的活性和细胞矿化作用进行成骨细胞鉴定。【结果】全骨髓贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，MSCs在含体积分数为10% 胎牛血清的低糖DMEM（L-DMEM）培养液中生长性状相对稳定，增殖速度快；诱导条件下，细胞ALP活性明显增高，并出现了矿化结节。【结论】建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法，成骨能力肯定，为中药蛋白质组学研究提供材料基础。 【关键词】 骨髓间充质干细胞/病理学； 细胞培养，体外的； 组织工程 　　骨髓间充质干细胞（MSCs）在体内外诱导因子的作用下，可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞和星形胶质细胞转化，具有很大的可塑性［1］，这使其在组织工程、细胞治疗等方面成为研究的热点［2］。为更好地将MSCs应用于骨质疏松症、骨坏死、骨缺损，本实验通过体外细胞培养的方法将MSCs从骨髓中分离纯化，观察MSCs在体外的扩增、鉴定，并诱导其定向成骨分化。现报道如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 SD大鼠6只，SPF级，体质量140~160 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为：0025033。 　　1.2 主要试剂与仪器 低糖DMEM （L-DMEM，美国Gibco 公司，GNM31600）；兔抗大鼠CD34（BA0532）、CD44（BA0321）、CD54（BA0541）（武汉博士德公司）；高糖DMEM（Hyclone，SH30022.01B）；胎牛血清（Hyclone，SV30087.01）；胰蛋白酶（Hyclone，SV30042.01）；β-甘油磷酸钠（美国Simga公司）；地塞米松（美国Sigma公司）；D-hanks（美国Simga公司）；维生素C（美国Sigma公司）；生物素化抗生蛋白链菌素复合物（streptavidin biotin complex，SABC）（SA1022）试剂盒（武汉博士德公司）；二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（AR1022）（武汉博士德公司）；其他试剂均为国产分析纯。 C02恒温培养箱（Sheldon Manufactruing.Inc,model No: 2323-2 shellab，USA）；3k-15低温离心机（美国Sigma）；DL-CJ-IF超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），MPS 60倒置显微镜（Leika DMIRB）；超纯水系统（MILLPORE,SAS 67120MOISHEMA,France） 　　1.3 培养液配制 完全培养液：低糖DMEM（含体积分数为10％胎牛血清，10 g/L青霉素、链霉素）；诱导分化培养液：高糖DMEM（含体积分数10％胎牛血清，10 g/L青霉素、链霉素）中加入β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C，终浓度分别为10 mmol／L、10-8 mol／L、50 μmol/L。 　　1 .4 骨髓间充质干细胞的分离［ 3-4］ 取健康成年SD大鼠（150 g左右），1 g/L新洁尔灭浸泡30 min后，断颈处死，碘伏消毒，体积分数为75%的酒精消毒，铺无菌单盖住上身；无菌条件下取双侧股骨、胫骨，除去骨表面附着的软组织，用L-DMEM浸泡清洗;用弯钳将两端骨骺切除，显露骨髓腔。用10 mL注射器吸取L-DMEM培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1 000 r/min离心20 min，离心后去上清，用完全培养液重悬，入培养瓶中，用完全培养液培养。 　　1.5 骨髓基质干细胞的原代和传代培养 将上述所得细胞悬液接种于25 mL塑料培养瓶中，置37℃ 、体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养。于培养后的第3天更换培养液以更新细胞代谢环境。以后每3 d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80％时，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.4 g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化，按1：2传代培养。 　　1.6 大鼠骨髓MSCs的生长曲线测定 取生长良好的第2、3代细胞（P2、P3），2.5 g/L 胰蛋白酶消化，1×104／mL接种于24孔板，每天各取3孔消化计数，每孔计数3次，连续