氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、 鉴定及应用.docVIP

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、 鉴定及应用 【摘要】 目的: 制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定与应用。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体, 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备mAb, 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定, 通过免疫沉淀联合质谱、 UniZAP XR表达文库筛选鉴定抗原, 借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物。结果: 获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb 的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）, 该 mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化、 免疫荧光染色、 免疫沉淀实验和复合物的分离。结论: 成功制备了抗人CPSI的mAb, 为CPSI的研究提供了有力的工具。 【关键词】 氨甲酰磷酸合成酶(CPSI) 单克隆抗体 特性 氨甲酰磷酸合成酶（human carbamyl phosphate synthetase 1, CPSI/EC 6.3.4.16）是肝脏细胞能量代谢中尿素循环中的关键酶, 而尿素循环的代谢途径为肝脏细胞线粒体的一项主要功能, 氨甲酰磷酸合成酶可以去除细胞中多余的氨, 此酶缺失可以导致高氨血症。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中, 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb, 获得3株鼠抗人CPS1 mAb, 并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究CPS1在代谢中的作用提供参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白, 由本室制备; 弗氏佐剂购自Sigma公司; 羊抗鼠IgGHRP购自中山公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱购自Amersham公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜购自Amersham公司; ECL反应试剂盒购自Amersham公司; 半干转印仪购自BioRad公司; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备 　　成人肝组织匀浆700～750 r/min, 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min, 取上清, 10 000 g离心10 min, 沉淀即为线粒体, 用匀浆缓冲液洗2次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品, 离心后取上清, 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度, 计算线粒体的得率, 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度, SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量(Mr)。 　　1.2.2 鼠抗人mAb的制备 　　将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化, 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次, 1周后经尾静脉取血, 分离血清, ELISA法测定效价。融合前3 d进行加强免疫, 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合, 采用杂交瘤技术制备mAb 。 　　1.2.3 抗原的鉴定 　　 (1)抗原的质谱鉴定: 应用mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原, 并进行SDSPAGE电泳, 根据Western blot结果显示的阳 性条带, 从SDSPAGE胶上切下相应的条带, 酶切, 质谱鉴定。(2)抗原的UniZAP XR表达文库筛选鉴定: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中, 37℃震荡培养至A600为0.7左右, 3 000 r/min下离心10 min, 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5, 取适当稀释的文库60 μL(含约50 000个噬菌体)与600 μL重悬的XL1BLUE MRF混匀后37℃温育20 min, 铺至150 mm的NZYLB平板上, 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见, 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面, 37℃继续培养3.5 h, 用防水墨水定位后, 剥离滤膜, 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆, 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。 　　1.2.4 mAb的鉴定 　　(1)Western blot 分析: 线粒体总蛋白经SDSPAGE后, 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h, 然后加入1∶ 2 000稀释的mAb, 室温下孵育2 h, TBST缓冲液洗膜后, 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000