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实验一 聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果与讨论 分子生物学其它常用实验仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器 * * 实验目的 掌握PCR反应的原理及技术 实验原理 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）简称PCR技术，是一种体外扩增特异DNA片段的技术。 利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。 PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。 pBC SK map PCR：变性－退火－延伸 PCR (c) (b) 引物2 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ (d) 新引物 5’ 3’ 靶DNA的扩增 (a) 5’ 3’ 引物1 3’ 5’ 3’ 5’ 引物2互补链 引物1互补链 单位长度的链 不同长度的链 5’ 3’ 3’ 5’ 引物1互补链 引物2互补链 目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图 (e) (f) (g) 反应分为三步： 变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA； 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 延伸： 在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106-107个拷贝。 PCR技术的参数主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子。 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器 1. PCR仪 2. 台式离心机 3. 微量取液器 4. 紫外荧光观测仪 5. 高压灭菌的微量离心管 6. DNA扩增系统 7. 琼脂糖凝胶电泳系统 （二）材料 模板DNA :pMD18-T (KS )载体 （三）试剂 1. 10×PCR buffer 2. dNTPs ：2.5mM ×4 3. Taq 酶： 5U/μL 4. 引物1和2(T3,T7) ： 2μmol/L pMD18-T Vector ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 四、实验步骤 1. 在0.2ml Eppendorf管内配制25μl反应体系： ddH2O： 18.25μl (25-6.75) ×7 10×PCR buffer： 2.5μl×7 dNTPs（2.5mM×4） 2μl ×7 M13-F(10μM)： 0.5μl ×7 M13-R(10μM)： 0.5μl ×7 Taq 酶： 0.25ul ×7 模板： 1μl /每管 注：做一管阴性对照，即模板为灭菌的双蒸水 或在0.2ml Eppendorf管内配制50μl反应体系： ddH2O： 31.5μl 10×PCR buffer： 5μl dNTPs（2.5mM×4）：4μl 引物1 (10μM)： 2μl 引物2 (10μM)： 2μl MgCl2 3μl Taq 酶： 0.5ul 模板：