2010级研究生双向与光合实验.docVIP

2010级研究生《植物科学实验技术》 双向电泳技术（524 lab） 一、实验目的： 了解蛋白质组学研究中的基本实验设计思路，掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析。 二、材料与试剂 材料：①叶片（墨兰、石斛）②花芽（春石斛、蝴蝶兰）③蝴蝶兰花瓣（白色、红色）④蝴蝶兰花苞 仪器：聚焦仪，天平，电子秤，适用于2ml、10ml、50ml离心管的高速离心机，PH计，磁力搅拌器，低温冰箱，真空泵，紫外分光光度计，水浴锅等 试剂：三氯乙酸（TCA），丙酮，β-巯基乙醇，Tris-base，牛血清蛋白，考马斯亮蓝G-250，无水乙醇，尿素（Urea），硫脲（Thiourea）,CHAPS，DTT，碘乙酰胺IAA，IPG buffer，PH3-10,IPG预制胶条（7cm，PH3-10），丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，SDS，过硫酸铵(Ap),甘氨酸Gly，硫酸铵，甲醇，溴酚蓝，超纯水，液氮,正磷酸等 器皿：研钵，10ml、50ml、100ml、500ml容量瓶，10ml、500ml烧杯，1.5ml、50ml离心管， 50ml量筒，1ml、5ml、2.5ul、10ul、20ul、100ul微量移液器，100ml棕色瓶，冰盒，滤纸，玻璃棒，记号笔，布氏漏斗，试管等 三、实验流程 I 样品制备 A：蛋白质制备方法（全程低温，操作尽量快、准；双向电泳最重要、最基础步骤） A-1 TCA/丙酮沉淀法 —— 墨兰、石斛叶片 1. 称取0.3克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉 2. 粉末转移至10ml离心管中，加入6-8ml 10%TCA/丙酮，-20℃沉淀过夜（至少2小时），震荡几次 3. 取沉淀过夜的样品离心4. 向沉淀中加入6-8ml冷丙酮，混匀并进行重量平衡，-20℃沉淀20min,离心（13200rpm、4℃、30min）弃上清。（此过程重复三次） 5. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀并进行天平平衡，-20℃沉淀20min,然后离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清。（此过程重复两次） 6. 转移沉淀到1.5ml离心管中，加1ml 冷丙酮洗涤、沉淀两次（离心0.5min） 7. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉，-80℃低温保存。 (补充：醋酸铵/甲醇沉淀法:基本步骤同TCA/丙酮沉淀法，只是第2步加入的是0.1M醋酸铵/甲醇) A-2酚抽提法 —— 石斛、蝴蝶兰花芽 1. 称取0.3克左右样品，在预冷的研钵中，液氮研磨成粉 2. 粉末转移至10ml离心管中，加入酚抽提液与水饱和酚混匀，离心（13200rpm、4℃、20min） 3. 吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇（①液），剩余下层水相，加入Tris饱和酚混匀，离心（13200rpm、15℃、20min） 4. 吸取上层酚相，加入0.1M醋酸铵甲醇（②液），下层水相及杂质丢弃，①和②-20℃沉淀过夜（4h以上） 5. 取沉淀过夜的样品. 向沉淀中加6-8ml 80%冷丙酮混匀，-20℃沉淀20min,然后离心（13200rpm、4℃、30min），弃上清。 7. 转移沉淀到1.5ml离心管中，加1ml 冷丙酮洗涤、离心沉淀两次（离心0.5min） 8. 真空冰浴抽滤，干燥沉淀至干粉，-80℃低温保存。 A-3 Tris-HCl提取缓冲液1.0 g花瓣，液氮研磨加5 Tris-HCl提取缓冲液冰上悬浮 min，离心（13200rpm、4℃、15min ） 3. 取上清液加入预冷的0.1M 醋酸铵甲醇，-20℃条件下沉淀过夜。4. 取沉淀过夜的样品沉淀10ml 0.1M醋酸铵甲醇溶液洗涤，弃上清。该步骤重复3次。5. 沉淀ml预冷80%丙酮弃上清。2次6. 沉淀分装到1.5ml离心管中7. 真空冰浴抽滤，干燥干粉-80℃低温保存。A-4 蝴蝶兰花苞（两种方法：酚抽提法、Tris-HCl提取缓冲液A-2和A-3 试剂： TCA—丙酮：10% TCA，0.07%?-巯基乙醇，以丙酮为溶剂。置于-20℃冰箱保存。 冷丙酮 ：含有0.07%?-巯基乙醇的丙酮，置于-20℃冰箱保存。 80%冷丙酮：80%丙酮，0.07%?-巯基乙醇，用双蒸水定容。置于-20℃冰箱保存。 0.1M醋酸铵-甲醇：醋酸铵0.7708g，甲醇定容。Tris-HCl提取缓冲液?-巯基乙醇2%（v/v）现用现加）。置于4℃冰箱保存。 Tris-HCl提取缓冲液：0.1M Tris-HCl（pH 8.0），5 %（w/v）蔗糖，2%（w/v）SDS，5%（v/v）β-巯基乙醇，2m PMSF（4℃保存） B：Brandford 法定量蛋白 1) 考马斯亮蓝G-250试剂： 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25ml 90％乙醇，加入50 ml 85％正磷酸，用双蒸水定容到50