SSBP的表达纯化工艺流程.docVIP

SSBP的表达纯化工艺流程 目的 本流程为自表达SSBP的表达纯化工艺规范，指导研究人员正确表达SSBP并保证产品质量。 二、菌株和质粒载体 工程菌：E. coli Arctic ExpressTM； 质粒：pET28a（+）； 分子量：24 kDa 三、仪器 Beckman 21R型冷冻离心机（美国，贝克曼库尔特有限公司）；THZ-03M2R小型冷冻空气浴恒温摇床（上海申能博彩生物科技有限公司）；SW-CJ-TFD单人单面净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；FM70A雪花型制冰机（美国GRANT公司）；BS110S电子天平（中国赛多利斯电子天平）；SS-245自动蒸汽消毒柜（日本TOMY公司）；Ultraschallprozessor超声细胞破碎仪（德国，dr.hielsoher）；核酸蛋白检测仪（上海琪特分析仪器有限公司）；恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）；离心过滤管（美国，Millipore公司）。 四、试剂 异丙基硫代-β-D- 半乳糖苷(IPTG)、溶菌酶(Lysozyme)：购自Amresco公司；卡那霉素：购自生物工程上海有限责任公司；酵母提取物、胰蛋白胨：购自Oxoid公司；Ni+柱亲和树脂：购自美国GE Healthcare；纯化用水；NiSO4；NaCl；咪唑；Tris；10%BSA；EDTA；HAc；KH2PO4；KCl；Na2PO4·12H2O；DTT；硫酸铵；甘油；乙二醇；等 五、表达及纯化流程 （1）接菌：取出经过表达筛选的SSBP菌株，接于装有5 mL LB培养基（含千分之一卡那霉素，终浓度30 μg/mL）的无菌试管，37 ℃，160 r/min振摇培养过夜。 （2）转菌：分别取1 mL菌液接入2瓶100 mL 含卡那霉素的LB培养基（装在500 mL锥形瓶中），37 ℃，160 r/min培养3 h。 （3）诱导表达：向锥形瓶中加入50 μL 1mol/L的IPTG（终浓度 0.5 mmol/L），30 ℃，160 r/min培养6 h。 （4）收菌：收集菌液，冷冻离心机4℃下，8 000 g离心3 min，弃去菌液，收集菌体重悬于少量binding buffer，吹打洗涤后继续以4℃，8 000 g离心3 min，弃去上清液，收集菌体重悬于30ml Binding buffer再加入10 μL 300mg/ml的溶菌酶（终浓度0.1mg/ml），室温放置60 min，放在冰箱中冷冻。 （5）次日将冷冻的酶解冻，制冰，超声破菌20-25min（在冰浴中进行），产物12 000 g, 20 min，4℃ 离心，留上清液待纯化。离心前后收集菌液用于电泳。 （6）纯化：采用Ni+柱亲和层析法纯化，将纯化柱连接到核酸蛋白检测仪，调节紫外光波长280nm处；1： 3倍体积纯化用水冲洗树脂，至读数不变且接近于“0”；2： 5倍体积1×Charge buffer洗涤；3： 3-5倍体积的1×Binding buffer平衡，至读数接近于“0”，必要时仪器可调零；4： 把收集的上清上柱，调整流速为10柱体积/h，即1.67 mL/10 min，约8-9s/滴，收集吸光度最高处的穿透液用于电泳；5： 样品上完后，5倍体积的1× Binding buffer洗柱子，至读数低于0.1左右； 6： 5倍体积30 mM咪唑洗脱，收集读数最高处的穿透液用于电泳；7：5倍体积:60 mM咪唑洗脱，收集读数最高处的穿透液用于电泳；8： 5倍体积300 mM咪唑洗脱，收集读数最高处的穿透液用于电泳，并收集信号升高处流出的所有的部分，用于超滤；9： 5倍体积1× Strip buffer洗柱子直至柱子变成白色，并用清水洗涤皮管； 9： 5倍体积的纯化用水将柱子清洗干净； （7）超滤：使用30 kDa的超滤管，8 000 g，超滤至存留很少的液体时1:1加入储存缓冲液洗涤，继续离心，待样品液体体积很少时加入10% BSA至终浓度为2%，或1:1加入甘油，存储于-30 ℃。 六、注意事项 （1）诱导表达时第1、2、3步均在超净台中完成，使用超净台前应紫外照射杀菌30min，注意无菌操作。 （2）将500ml锥形瓶（含100ml LB培养基）放入摇床培养时应除去封口的报纸，留下透气膜以保证通气。 （3）如纯化时流速极慢严重影响实验速度，可尝试吹打柱床，如情况未见好转，在确定皮管及核算蛋白检测仪未发生堵塞的情况下，可用恒流泵3-4rpm加速引流。 （4）超滤离心管可重复使用3次左右。 七、附录1：Buffer及其配制 卡那霉素配制成30mg/ml（即1ml无菌水溶解30mg卡那霉素），使用时按千分之一量加入到LB培养基中（即100ml培养基中加100ul）。 LB培养基:1g 蛋白胨；1g 氯化钠；0.5g 酵母粉；