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始旋链霉菌HCCB20038 snaA、snaB和snaC基因的克隆、序列分析及原核表达_药学论文 始旋链霉菌HCCB20038 snaA、snaB和snaC基因的克隆、序列分析及原核表达_药学论文 作者：王宁波 殷瑜 黄为一 朱丽 陈代杰【摘要】 以始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)HCCB20038的染色体DNA为模板，通过优化PCR条件扩增出FMN还原酶、PIIA合酶的基因片段。与文献报道的基因序列做同源比较，snaA和snaB碱基序列分别只有一个碱基的差异，snaC碱基序列完全匹配。将snaA、snaB和snaC的基因片段插入原核表达载体pET30a中，并转化至大肠埃希菌BL21 (DE3)。SDSPAGE结果表明，经IPTG诱导后基因分别得到表达。 【关键词】 始旋链霉菌； 普那霉素； 基因克隆； 表达 　　Cloning, sequencing and prokaryotic expression of snaA, snaB and snaC gene　from Streptomyces pristinaespiralis HCCB20038 　　ABSTRACT Through PCR method and optimization of PCR reaction system, snaA, snaB and snaC gene were obtained from Streptomyces pristinaespiralis HCCB20038. Analysis of snaA, snaB and snaC gene sequences showed that there was only one base, different from the reported sequences of snaA and snaB respectively. snaC sequence was identical to the reported sequence. snaA, snaB and snaC gene were inserted into pET30a vector and were transformed into E.coli BL21 (DE3) strain. After induced by IPTG, the result of SDSPAGE showed that they were expressed. 　　KEY WORDS Streptomyces pristinaespiralis; Pristinamycin; Gene cloning; Expression 　　普那霉素［1，2］(pristinamycins)系始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)产生，由普那霉素I(pristinamycin I，PI)和普那霉素II(pristinamycin II，PII)组成。普那霉素I由普那霉素IA、IB、IC、ID、IE、IF、IG、IH和III等一系列同系物组成；普那霉素II由普那霉素IIA、IIB、IIC、IID、IIE、IIF和IIG等一系列同系物构成，其中PIA和PIIA是普那霉素的主要组分。 　　关于PIIA的生物合成途径目前还不是很清楚，但活性组分PIIB是活性组分PIIA生物合成途径的前体已被证实。 　　Thibaut等［3］在始旋链霉菌体内利用14C标记方法获得了PIIB到PIIA的高水平转化。说明PIIB是PIIA生物合成途径中的一个中间体，体外研究证明PIIB到PIIA的氧化是一个复杂的过程，需要NADH、FMN和O2。两个酶是催化这个过程所必须的：FMN还原酶(FMN reductase)和PIIA合酶(PIIA synthase)(Fig.1)。 　　PIIA合酶由两个不同亚基(SnaA和SnaB)组成，分子量约为49.6和34.7ku；FMN还原酶为SnaC，分子量约为29.8ku。PIIA合酶主要氧化PIIB中第26，27Fig.1 Catalytic reactions with FMN reductase and PIIA synthase位上CC单键为C=C双键，氧化过程所需的电子供体则由FMNH2供给。 　　目前国内对始旋链霉菌基因方面的研究未见报道，国外对普那霉素的生物合成基因方面的研究也不是很多。本文成功地从始旋链霉菌中获得了snaA、snaB和snaC基因的克隆，并初步完成了该酶的基因序列的分析及原核表达，为后续构建高产基因工程菌打下基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株和质粒 始旋链霉菌HCCB200