应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性_医学论文.docVIP

应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性_医学论文 应用LacZ报告系统研究白念珠菌HYR1基因的启动子活性_医学论文 陈江汉，汪晓军，徐 红，顾菊林，潘炜华，刘晓刚，陈孙孝，温 海　　　　　　　　　　　　【摘要】 目的 应用LacZ基因报告系统明确白念珠菌相转换特异基因HYR1上游脯氨酸相关的启动子片段。方法 采用PCR、基因重组、酵母转化和报告基因测活，比较不同HYR1基因上游1800bp内不同片段的启动子活性。结果 -400~-200bp区域存在启动调控活性，其他区域未见相关的启动活性。结论 在HYR1基因上游-400~-200bp间存在与脯氨酸相关的基因调控元件，β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因系统可以用来研究白念珠菌基因调控活性。 【关键词】 白念珠菌；脯氨酸；基因 【Abstract】 Objective With PNG17(LacZ) as reporter gene to clarify the fractional activity of promoters concerned with proline from candida albicans yeast-hyphal regulation gene(HYR1).Methods Sequence between 1800bp upstream of the start of transcription and 43bp downstream of this site was investigated with serial 5’-deletion，the 5’-deletion promoters were recombinted with vector PNG17(LacZ) as reporter gene and the constructs were transiently transformed EGY48 yeast.Results -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene had activity as promoter.Conclusion In the region of -400～-200bp of candida albicans HYR1 gene，there was regulatory element concerned with proline.PNG17(LacZ) as reporter gene is practicable. 【Key words】 candida albicansprolinegene 白念珠菌是最重要的致病真菌，其基因组计划已经完成，越来越多的基因的功能和定位被阐明。然而由于缺乏合适的报告系统，相关基因，特别是一些重要基因的调控机制仍未明确，因此迫切需要找到恰当的报告基因。HYR1基因已被证明是白念珠菌菌相转换的特异基因［1］，脯氨酸是菌丝生长重要的诱导者，HYR1基因上游是否存在其顺式调控元件、它们的分布如何等这些问题尚无研究报道。本文应用含β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因的质粒PNG17与HYR1基因启动子（-1800~+43bp）组成的重组体，及酵母转化技术，逐段研究HYR1基因上游脯氨酸相关的启动子序列。 1 材料与方法 1.1 菌株和培养条件 白念珠菌为ATCC10261。白念珠菌在YEPD培养基中（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母抽提物）培养至指数生长后期，按标准的酵母菌DNA抽提法分离染色体DNA以用作模板。 1.2 研究及对照片段的选择 对HYR1基因上游1.8kb左右的序列进行了研究，根据DNA ssist 2.0软件的分析结果，分段克隆了不等长的片段，它们分别是HYR1基因转录起始位点上游200bp、400bp、600bp，1000bp、1400bp、1800bp等，见图1。 1.3 报告系统的应用 载体PNG17是大肠杆菌、酵母菌的穿梭质粒，带有β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因，但基因上游没有启动元件。PNG17为Terrance G.Cooper教授（Department of Microbiology and Immunology，University of Tennessee）所赠，质粒图谱如图2。图1 克隆片段示意图图2 PNG17质粒图谱 1.4 重组体的构建 重组体中所含的启动子即是所要研究的白念珠菌菌相转换基因HYR1转录起始位点上游的各个大小不同的DNA片断。它们具有相同3’端，分别对应于HYR1基因上游-1800~+43bp，-1400~+43bp，-1000~+43bp，-600~+43bp，-400~+43bp，-200~+43bp，来自于以白念珠