应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达_医学论文.docVIP

应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达_医学论文 应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达_医学论文 作者：谢书阳 王萍玉 姚宝洪 焦飞 王桂兰 杨成 【关键词】 红细胞系特异性启动子 荧光蛋白 基因表达 【Abstract】 Objective Studing the effect of erythroid-specific promoter can effectively drive expression of green/red fluorescence protein(GFP/RFP) in K562 cells. Methods Erythroid-specific promoter(β globin promoter) was amplified by PCR from human genome DNA, which was cloned into pcDNA vector to drive GFP/RFP gene expression. Then the vectors were transfected into K562 cells to prove the effect of the promoter by using fluorescence microscopy and RT-PCR.Results Fluorescence microscopy showed that GFP/RFP can strongly express in K562 cells. And the mRNA was also shown to express effectively by RT-PCR analysis.Conclusion The erythroid-specific promoter can obviously drive gene expression in K562 cells, which is valuable for gene therapy to leukemia as well as other hematology diseases. 【Key words】 erythroid-specific promoter,fluorescence protein,gene expression 人类珠蛋白基因是一种研究人类基因组结构与功能相关性的理想材料。珠蛋白基因的表达，具有发育阶段特异性和珠蛋白表达的组织特异性［1］。而启动子在保证珠蛋白各功能基因组织及发育阶段特异性表达方面起重要作用［2］。因此克隆β-珠蛋白启动子对血液病的治疗和基因表达调控研究具有重要价值。本实验旨在克隆β-珠蛋白启动子，用其驱动目的基因在造血细胞系中表达，验证启动子的有效性，为血液病基因治疗作基础准备。 1 材料与方法 1.1 材料 脂质体2000购自Invitrogen 公司，RNA 提取试剂盒购自U-GENE公司，MluI、NheI、SpeI等酶、逆转录酶购自TaKaRa公司，K562细胞株购自中科院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、胎牛血清购自GIBCO公司，GFP和RFP载体由山东大学崔行教授惠赠。 1.2 启动子的扩增 从人的基因组DNA中扩增β珠蛋白启动子，引物序列正向：5′-ATTCAAACTTCCGCAGAACACT-3′，反向：5′-GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCA-3′；PCR反应条件为：94℃ 3 min，1个循环； 94℃ 30 s，58℃ 45 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min，1个循环。将扩增片段（2.1 kB）克隆到T载体上，得到T-Pro载体，并测序证明干扰片段序列正确。 1.3 载体构建 利用MluI（酶切后补平）和NheI酶切pcDNA3.1(-)载体，用SphI （酶切后补平）和SpeI酶切T-Pro载体，将启动子克隆至pcDNA3.1(-)载体上构建p-Pro载体。然后，利用EcoRI 和AflII酶切位点，将GFP 从PEGFP-N载体克隆至p-Pro载体上，构建p-Pro-GFP载体(用β-珠蛋白启动子启动GFP表达)。利用XbaI和BamHI酶切位点，将RFP从pDsRed载体克隆至p-Pro载体上，构建p-Pro-RFP载体(用β-珠蛋白启动子启动RFP表达)，在体结构见图1。 Pro:人β珠蛋白启动子； GFP/RFP： 绿色荧光或红色荧光蛋白基因； PolyA：多聚腺嘌呤核苷酸 图1 GFP/RFP表达载体结构图 1.4 细胞培养及转染 K562细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养。然后，将1 μg p-Pro-GFP载体（或p-P