应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库_医学论文.docVIP

应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库_医学论文 应用细胞内PCR技术构建及筛选白癜风噬菌体抗体库_医学论文 作者：刘玲，田艳丽，李春英，高天文 【关键词】 白癜风；聚合酶链反应；噬菌体抗体库；自身抗体 　　Construction and screening of human vitiligo phage autoantibody library based on incell PCR 　　【Abstract】 AIM: To obtain in situ pairing of the variable region genes of the heavy and light chains of vitiligo patients lymphocytes, then construct and screen a human ScFv phage antibody library. METHODS: We amplified in situ pairing of the variable region genes of the immunoglobulin heavy and light chains using the incell PCR together with Crerecombination, constructed and panned a human ScFv phage antibody library, and screened it with pigment cell suspension, then detected the activity of positive clones. RESULTS: We constructed an antibody library of 3×l06 in size, and obtained one specific autoantibody against melanocyte membrane antigens. CONCLUSION: Incell PCR together with human phage antibody library may be useful tools for the study of vitiligo antibody gene family and the VH/VL pairing that occurs during the autoimmune process. 　　【Keywords】 vitiligo polymerase chain reaction phage antibody library autoantibodies 　　【摘要】 目的： 克隆白癜风患者淋巴细胞中原始配对的自身抗体基因，构建噬菌体抗体库并筛选针对黑素细胞膜抗原的特异性抗体. 方法： 细胞内PCR法扩增人免疫球蛋白轻链和重链可变区基因，Cre重组酶介导下完成单个细胞内的轻重链连接，获得反映体内原始配对信息的单链抗体可变区基因，构建噬菌体抗体库，筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结果： 构建完成库容量约为3×l06的噬菌体抗体库，筛选得到1株针对黑素细胞膜抗原的自身抗体. 结论： 利用细胞内PCR技术和噬菌体抗体库技术成功构建免疫文库，为进一步研究自身抗体在白癜风发生发展过程中的作用奠定了基础. 　　【关键词】 白癜风；聚合酶链反应；噬菌体抗体库；自身抗体 　　0引言 　　白癜风是一种常见的皮肤色素脱失性疾病，病因尚未完全明确，近年的研究倾向于自身免疫在黑素细胞破坏中发挥了重要作用. 患者体内存在包括抗黑素细胞抗体在内的多种自身抗体［1］. 抗黑素细胞抗体针对多种黑素细胞成分，其滴度与疾病活动性平行［2］，部分抗体针对细胞膜抗原，在黑素细胞破坏中有重要作用. 我们在前面的实验中已经摸索出细胞内PCR扩增抗体基因的方法，成功扩增患者体内原始亲本配对的自身抗体基因［3］，进一步结合噬菌体抗体库技术，构建免疫文库并筛选针对黑素细胞膜抗原的自身抗体，为研究血清中抗体对黑素细胞的作用奠定了基础. 　　1材料和方法 　　1.1样本白癜风患者均来自西京医院皮肤科门诊，诊断依据白癜风临床分型及疗效标准（2003修订稿）［4］，选择进展期、面积较大（皮损面积占体表面积5%以上）的患者，其中男48例，女52例；年龄12~55（平均21）岁；平均病程2 mo；所有患者采血前3 mo内未接受皮质类固醇、免疫调节药物、光化学等系统治疗.　　1.2试剂免疫磁珠，CD19+单抗（BD Pharmingen公司），辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗人IgG和HRP标记羊抗鼠IgG（武汉博士德生物制品公司），蛋白酶K（Merck kGaA公司），PCR引物由赛百盛公司合