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抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究_医学论文 抗原致敏树突状细胞诱导CIK对胃癌细胞杀伤作用的研究_医学论文 作者：胡廷辉　应敏刚　郑秋红　龚福生　谢云青 　树突状细胞（dendritic cell，DC）是已知功能最强的抗原呈递细胞，是机体T淋巴细胞特异免疫应答的直接启动和调控者，在机体的抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。在体外培养DC并用肿瘤抗原致敏后，携带肿瘤抗原信息的DC，在体内外激活针对该肿瘤细胞的特异性杀伤细胞。本试验在体外用人胃癌细胞SGC提取肿瘤抗原致敏DC后诱导CIK，通过其对SGC的杀伤作用的研究为DC治疗胃癌的研究提供理论及试验依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 SGC由福建省肿瘤医院分子生物学研究室提供；rhIL?鄄2、rhIL?鄄4、CD3 mAb购自Peprotech公司；rhGM?鄄CSF、Ficoll淋巴细胞分离液购自军事医学科学院；胎牛血清(超级)购自杭州四季青生物制品公司；人AB血清由福建省血液中心提供；1640培养基购自Gibco公司；FITC标记的小鼠抗人CD83、HLA?鄄DR、CD14、CD86及同亚型对照抗体购于晶美生物工程有限公司。 1.2 方 法 1.2.1 SGC的培养 SGC在5％CO2、37℃条件下，用含有10％胎牛血清RPMI1640培养液常规培养。 1.2.2 肿瘤细胞总蛋白的获取 将培养贴壁肿瘤细胞用胰酶消化悬浮，离心弃上清，用无血清RPMI1640培养液重悬，超声破膜，30 000r/min超速离心90min，取上清。浓缩透析，调整蛋白浓度为25mg/ml，经0.22μm滤膜滤过除菌，－80℃保存。 1.2.3 DC的培养[1] 无菌条件下采集的正常人抗凝外周全血，经淋巴细胞分离液梯度离心，获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，调整细胞浓度至5×107/ml，加1ml至6孔板内培养箱中培养2h，吸掉上清，用培养液洗去非黏附细胞，获得贴壁细胞，每孔再加入3ml 含有rhIL?鄄4 （500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培养液，2~3d半量换液1次。 1.2.4 抗原负载DC及表型鉴定 将上述培养5d的DC 用含有rhIL?鄄4 （500U/ml）及rhGM?鄄CSF（500μg/ml）的10%AB血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1×106/ml，向6孔板内加入2ml的细胞，每孔加入肿瘤细胞总蛋白1ml（25mg），于第8d收集悬浮细胞为抗原致敏的DC。对照组加入无血清RPMI1640培养液1ml，于第8d收集悬浮细胞为空白的DC。分别收集第1d、第5d及第8d抗原致敏的DC，用流式细胞仪检测DC表面分子HLA?鄄DR、CD83、CD86、CD14表达。 1.2.5 CIK的培养[2] 同前法从外周血中获取单个核细胞，用含10%AB血清的RPMI1640悬浮细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养2h，取悬浮细胞，调整细胞数为1×106/ml，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液培养，2~3d半量换液1次至第8d。试验组用将其分别与空白的DC及抗原致敏的DC 按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb( 50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。对照组仅用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)的10%AB血清的RPMI1640培养液在6孔板内培养。5d后分别获取抗原致敏DC诱导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK为效应细胞。 1.2.6 混合淋巴细胞反应（MLR） 试验组收集成熟经抗原致敏及空白的DC，用含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb (50μg/L)10%AB血清的RPMI1640调整细胞数为1×106/ml。收集同时期培养的CTK用同样的培养液调整细胞数为1×107/ml。将100μlCIK分别与100μl经抗原致敏及空白的DC在96孔培养板中混合培养。对照组100μlCIK加入100μl含有IL?鄄2(250U/ml)、CD3 mAb 50μg/L10%AB血清的RPMI1640继续培养。72h后加入四甲基偶氮唑蓝（MTT）10μg，继续培养4h，离心弃去孔内上清，每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO）震荡10min，待结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm处测OD值（A），每组设3个复孔，取均值按下式计算： 刺激指数SI=A实验孔/A对照孔×100％ 1.2.7 细胞杀伤试验 用MTT比色法测定抗原致敏DC诱导CIK，空白的DC诱导CIK及CIK对