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抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定_医学论文 抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定_医学论文 【摘要】 目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。方法：以RT扩增Trio的1 173 bp的基因片段并克隆入pET28a(＋) 和pGEX表达载体中，表达并纯化Trio、Trio融合蛋白。用纯化的Trio融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用Trio亲和层析法进行纯化并采用Western blot法检测抗体生物学活性。结果：表达的Trio蛋白以包涵体的形式存在，用His亲和层析法分离纯化后得到较纯的Trio融合蛋白，以纯化的Trio免疫家兔制备的兔抗Trio的抗体，经Western blot分析显示该抗体可与果蝇S2细胞Trio特异性结合。结论：获得具有良好特异性的兔抗Trio抗体，为进一步研究Trio的功能奠定了基础。 【关键词】 Trio基因 原核表达 抗体制备 Trio基因是Dbl家族重要的一员，它编码的蛋白在人、小鼠、线虫、果蝇中具有高度的保守性。Trio能够活化Rho家族的GTPases，可能参与多种信号通路，已经发现它在轴突导向、神经细胞延伸和迁移中起着非常重要的作用，但该基因在果蝇中的功能尚不清楚 ［１］。本研究采用原核表达系统 ［２］制备并纯化了Trio融合蛋白，以纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔获得抗Trio抗体，为进一步研究Trio蛋白的功能奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)由本实验室保存。质粒pET28a(＋)、pGEX为Novagen公司产品；逆转录酶购自Promega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，CNBr活化的抗体纯化亲和层析柱Sepharose 4B为Amersham Pharmarcia公司产品；Western blot显影底物及BCA蛋白定量试剂盒均为Pierce公司产品,抗果蝇Tubulin抗体购自Sigma公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。 1.2 方法 ［3］ 1.2.1 目的基因的扩增 从野生型黑腹果蝇幼虫中提取总RNA，并逆转录为cDNA进行PCR扩增。上游引物的序列为 5′，下游引物的序列为5′（划线部分分别为BamHⅠ、Xho Ⅰ酶切位点）。PCR反应的参数为：94 ℃预变性3 min；94℃变性30 s，53℃变性1 min，72 ℃延伸1 min，共34个循环最后72 ℃延伸10 min。获得Trio 1 173 bp的基因片段。 1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 PCR产物分别经BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。割胶回收酶切片段，与经同样酶切的质粒pET28a(＋)和质粒pGEX于16 ℃连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含相应抗生素[质粒pET28a(＋)为卡那抗性,终质量浓度为25 mg·L-1；质粒pGEX为氨苄抗性，终质量浓度为50 mg·L-1]的固体培养基上，于37 ℃过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进行BamH Ⅰ、Xho Ⅰ酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a(＋)-Trio和pGEX)6CTrio。 1.2.3 目的蛋白的原核表达及纯化 将经酶切和测序鉴定的重组质粒pET28a(＋)和pGEX分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37 ℃培养过夜。次日按1∶50接种至1 L含卡那霉素（终质量浓度为25 mg·L-1）的新鲜LB液体培养基中，于37 ℃振荡培养至细菌浓度的A600 nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1 mmol·L-1，于37 ℃诱导表达3 h，离心收集菌体。菌体用1×PBS(pH 7.4)重悬，经超声裂解后，以10 000 r·min-1离心10 min收集上清和沉淀。经SDS分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris，pH 8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+树脂层析柱中用缓冲液B(8mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris，pH 6.3)洗柱，直至A280 nmlt0.01用缓冲液C(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1 NaH2PO4、10 mmol·L-1 Tris， pH 4.5)洗脱目的蛋白。收集的目的蛋白用SDS进行分析。 1.2.4 动物免疫及抗血清的制备 ［4］ 将纯化的Trio融合蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量后免疫家兔2只，每只每次融和蛋白的