护骨素基因启动子区T149 C基因型和等位基因频率分布的区域性差异_医学论文.docVIP

护骨素基因启动子区T149 C基因型和等位基因频率分布的区域性差异_医学论文 护骨素基因启动子区T149 C基因型和等位基因频率分布的区域性差异_医学论文 【摘要】 目的: 探讨绝经后汉族妇女护骨素(OPG)基因启动子区T149C基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域存在的分布差异. 方法: 用聚合酶链反应限制性片断长度多态性（PCRRELP）测定随机选取的89例西安市绝经后正常妇女和72例广州市绝经后正常妇女OPG基因T149C的基因型. 结果: 所选人群OPG基因T149C基因型频率分布在两地绝经正常妇女中均符合HardyWeiberg定律,而且其基因型在两组研究对象中分布差异有统计学意义（0.01）. 结论: 绝经后汉族妇女OPG基因启动子区T149C基因型和等位基因频率分布可能存在着区域性差异. 【关键词】 护骨素 多态性 启动子 基因 突变 0引言 护骨素(osteoprotegerin, OPG) 是TNF受体超家族成员,是由该前肽(401个氨基酸)切除21个氨基酸的信号肽产生的成熟肽(380个氨基酸),是目前已知唯一一个通过与定位于成骨细胞膜上的NFkB受体活化剂配体(receptor activation of NFkB ligand, RANKL)结合,从而封闭了成骨细胞诱导的破骨细胞分化成熟及其溶骨性骨吸收的可溶性饵受体［1］，与其他成员相比,OPG缺少跨膜域和细胞质区域,而OPG基因启动子区序列的变化可能影响到基因的转录和蛋白质表达水平［2］. 我们用限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析技术对绝经后中国大陆不同区域的汉族妇女OPG基因启动子T149C多态性进行分析,以期了解其基因型和等位基因频率在中国大陆不同区域是否存在着分布差异. 1对象和方法 1.1对象组Ⅰ为89例在陕西西安市居住10 a以上,平均年龄63.2（49~79）岁的绝经后正常妇女，组Ⅱ为72例在广东广州市居住10 a以上，平均年龄62.8（46~77）岁的绝经后正常妇女，彼此无亲缘关系,自然绝经时间超过5 a.同时不具有以下情况的汉族妇女作为研究对象，即除外甲亢、甲旁亢、糖尿病、皮质醇增多症、多发性骨髓瘤等所致的骨质疏松症患者，除外类风湿性关节炎、恶性肿瘤、消化道疾病及动脉粥样硬化患者，近期使用VD、钙剂、降钙素、雌激素及激素替代药物等影响骨代谢的药物的妇女. 调查和取样均征得受试者本人同意. 1.2方法 1.2.1引物设计与合成引物按GenBank网站(编号:AB 008821)和文献［3］提供的OPG基因启动子序列,用Primer Premier 5软件设计,引物序列为:上游引物5′CTGGAGACATATAACTTGAACA3′,下游引物,5′CCATCATCAAACCCCTATTGGT3′(上海生物工程公司合成),特异性扩增产物的片段为300 bp. 1.2.2DNA的提取外周静脉血2 mL,肝素抗凝,采用TaRaKa公司的试剂盒从全血中提取基因组DNA,提取的DNA溶于TE缓冲液,-20℃保存备用. 1.2.3PCRRFLP反应PCR反应体系为20 μL,其中基因组DNA 0.2 μg 10×Ex Taq扩增缓冲液上、下游引物各0.2 μmol/L dNTP各200 μmol/L Ex Taq DNA聚合酶1 U, PCR反应程序: 95℃预变性10 min后进行热循环.每个循环条件是: 94℃热变性1 min,51℃复性4 s, 72℃延伸1 min,共进行38个循环,循环完成后再于72℃延伸8 min. 5 μL反应产物于15g/L的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察扩增是否成功. 扩增产物为300 bp,取3个样本测序确认，其余经15 g/L琼脂糖凝胶电泳确定后，取PCR产物加过量的限制性内切酶XbaⅠ经37℃消化后,在25 g/L琼脂糖凝胶中分离酶解产物，紫外灯下确定基因型. 统计学处理: 采用SPSS11.0统计软件. χ2检验判断OPG基因启动子区T149基因型是否符合HardyWeinberg遗传平衡定律. 2结果 134例受试者经序列分析后在OPG基因启动子区找到了单核苷酸多态性T149C位点(图1). 两组实验对象均检测到TT型、CC型和CT型三种基因型，存在XbaⅠ酶切位点的纯合子TT,显示153 bp和147 bp两条带缺乏XbaⅠ酶切位点的野生型纯合子CC,显示300 bp一条带杂合子TC则显示上述三条带(图2). OPG基因启动子区T149C基因型和等位基因频率分布见表1,其等位基因在组I和组II中的频率分布符合HardyWeinber