曲美他嗪对糖尿病心肌病变大鼠MMP-9、TIMP-1与TGF-β1 蛋白表达的影响_医学论文.docVIP

曲美他嗪对糖尿病心肌病变大鼠MMP-9、TIMP-1与TGF-β1 蛋白表达的影响_医学论文 曲美他嗪对糖尿病心肌病变大鼠MMP-9、TIMP-1与TGF-β1 蛋白表达的影响_医学论文 【摘要】目的探讨曲美他嗪对糖尿病(DM)大鼠心肌纤维化的影响。方法SD大鼠50只，随机分为对照组（NC），糖尿病心肌病组(DCM)，曲美他嗪治疗组(QMTQ)。免疫组化法、Western印迹技术检测转化生长因子TGF-β1、基质金属蛋白酶(MMP)-9及组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-l蛋白表达及含量。结果与NC组相比，DCM组中MMP-9、TIMP-1及TGF-β1蛋白表达及含量均明显升高．MMP-9／TIMP-l比值降低。QMTQ组上述异常均明显减轻。结论MMP-9、TIMP-l及TGF-β1三者平衡失调可能是使DM心肌纤维化发生的机制之一，曲美他嗪可能是通过下调TGF-β1表达，升高MMP-9/TIMP-1比值，保持心肌间质胶原合成和降解的动态平衡，而抑制糖尿病心肌纤维化的发生。 【关键词】曲美他嗪；糖尿病心肌纤维化；转化生长因子；基质金属蛋白酶 DCM作为DM的一种独特的心脏并发症已得到公认，其主要病理改变为心肌细胞肥大、凋亡和心脏间质纤维化(MF)，其纤维化的发生机制不完全清楚。基质金属蛋白酶/基质金属蛋白酶抑制物（MMPS/TIMPS）共同构成体内调节细胞外基质动态平衡的最重要的系统，参与了多种原因所致的心脏间质纤维化过程[1]。曲美他嗪作为改善心肌细胞能量代谢药物已在临床中已广泛应用，但其对糖尿病心肌纤维化的研究报道较少。本试验予曲美他嗪对DM大鼠MF的影响，探讨MMP-9/TIMP-1及TGF-β1在DCM发生过程中的作用，为临床DCM的治疗提供参考。 1对象和方法 1.1对象 选2月龄健康雄性SD大鼠（180～200g）50只（由辽宁医学院实验动物中心提供）；链脲佐菌素（STZ）（购自美国Sigma公司）；曲美他嗪（武汉福达医药化工有限公司）；MedLab生物信号采集处理系统(南京美易公司)；TUNEL试剂盒（购自北京博奥森生物技术有限公司）；P53、Bax、Bcl-2兔抗小鼠单克隆抗体（购自北京中杉金桥生物有限公司）。 1.2模型与分组 健康雄性SD大鼠50只，随机分出10只作为正常对照组（NC），其余以45mg·Kg-1一次性尾静脉注射1%STZ溶液，正常对照组注入等量容积上述缓冲液。注射后72h采尾静脉血测血糖，血糖浓度大于16.7mmol·L-1者为糖尿病大鼠模型。糖尿病模型形成后，普通饲料喂食6周，随机抽取大鼠10只，取心肌组织观察微细结构，糖尿病心肌病变模型形成标准为：心肌肌原纤维排列紊乱，局部断裂明显，肌丝成分减少，间质胶原纤维增生；心肌内微血管内皮细胞明显肿胀，核染色质边集，基底膜出现不规则明显增厚，微血管瘤形成；线粒体肿胀变形、嵴稀疏，排列紊乱，结构不清。按随机数字表方法将糖尿病大鼠随机分为两组：糖尿病心肌病组(DCM)，曲美他嗪(QMTQ)治疗组。最终用于实验的动物为对照组10只，模型组10只，治疗组10只。糖尿病大鼠心肌病变模型制备成功后开始给药，持续6周。治疗组给予曲美他嗪10mg·kg-1，每天灌胃一次，给药容量为10ml·Kg-1，NC组和DCM组给予等容量纯净水。 1.3指标测定 1.3.1免疫组化检测测定MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白表达水平 石蜡切片放入恒温水浴槽烤片2h，常规酒精从低到高浓度脱蜡至水，置入3%H2O2中灭活内源性过氧化物酶。将切片浸入含0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的高压锅内，盖上压力阀至喷气后持续2～3min抗原修复，自然冷却后PBS（pH7.2～7.6）洗涤。滴加5%BSA封闭液，室温20min，滴加1:100稀释MMP-9、TIMP-1、TGF-β1兔抗鼠单抗，4℃过夜。PBS洗涤后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温20min，PBS洗2min×3次。滴加SP复合物，室温20min，PBS洗2min×4次。DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，逐级酒精脱水，透明，封片。光镜下观察摄片，每张切片于左上、左下、右上、右下及中部随机取5个高倍视野（×400）测量灰度值，将每张切片平均灰度值作为该切片的灰度值。 1.3.2Western-blot法检测MMP-9、TIMP-1、TGF-β1蛋白含量 心肌组织匀浆取上清液，提取蛋白样品，按秩序加入泳道进行SDS．PAGE，转膜，抗体孵育，碱性磷酸酶显色。检测免疫复合物，利用凝胶自动分析软件，以β-actin作为内参，对蛋白条带进行分析得出数据文件。 1.4统计学分析 统计学分析应用SPSS16.0统计软件进行处理。实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较用单因素方差