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癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义_医学论文 癌症高表达蛋白在肝细胞肝癌中的表达及意义_医学论文 作者：张鹏 李卫华, 杨涛, 党军强, 陈勇 【关键词】 ,癌症高表达蛋白,肝细胞肝癌,细胞周期 　　[摘 要] 目的: 研究癌症高表达蛋白(Hec1)在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达和意义。方法: 采用免疫组化SP 法检测27例正常肝组织、 30例癌旁组织及62例HCC组织中Hec1的表达 用Western blot检测上述组织中Hec1蛋白的表达。结果: 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的阳性表达率分别为0%、 20.8%、 62.9%, 各组织中Hec1蛋白的表达差异均有统计学意义(0.05)。Hec1蛋白的表达与HCC的Edmondson分级、 侵袭转移显著相关。Western blot结果表明, 在正常肝、 癌旁组织及HCC组织中, Hec1蛋白的平均表达量的分别为0、 0.12±0.03、 0.89±0.16, 差异有统计学意义(0.05)。结论: Hec1蛋白的过度表达可能在HCC的发生和发展中起重要作用。 　　[关键词] 癌症高表达蛋白 肝细胞肝癌 细胞周期 　　原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见肿瘤之一, 在我国该病的发病率有上升趋势。癌症高表达蛋白(highlyexpressedincancer, Hec1)最初是通过酵母双杂交方法发现的, 由于在癌症中表达高于正常组织而被命名。Hec1蛋白属于细胞周期蛋白, 在终末分化的细胞中不表达, 在所有分裂旺盛的细胞中表达量高。我们应用免疫组化和Western blot技术检测Hec1蛋白在HCC组织的表达, 探讨Hec1蛋白与HCC侵袭和转移的关系。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 收集2005-04～2006-06第四军医大学西京医院手术切除的HCC标本62 例。年龄32～76（平均56）岁。按照Edmondson分级标准Ⅰ～Ⅱ级为高分化癌20 例, Ⅲ～Ⅳ级为低分化癌42 例。患者肝功能按Child 分级, A 级35 例, B 级27 例。直径≤5 cm的肿瘤24 例, 直径gt5 cm的肿瘤38例。HCC侵袭转移条件为: ①肝门淋巴结转移 ②肝内肿瘤数目≥2 个 ③门静脉癌栓形成 ④癌周多个卫星结节形成 ⑤癌组织浸润破坏肿瘤包膜。凡符合上述条件中的1 项以上者定为有转移倾向组, 共41例, 凡不符合上述5 项条件者为无转移倾向组, 共21 例。癌旁组织标本24 例。20例正常肝组织取自肝血管瘤手术切除标本作为对照组。手术中取材后均分成2 份: 1 份经100 mL/L甲醛固定, 石蜡包埋, 连续4 μm切片 1份置液氮速冻后于-70℃低温冰箱保存。所有标本均经病理组织学检查证实。鼠抗人Hec1单克隆抗体(mAb)为中国科技大学生命科学院姚雪彪教授提供, 羊抗鼠(二抗)、 SP试剂盒购自北京中山公司。ECL发光液为Pierce公司产品。GAPDH(抗3磷酸甘油醛脱氢酶, mAb)标准内参照为上海康成生物公司产品。Triton X100、 二硫苏糖醇(DTT)、 PMSF、 Aprotinin为Sigma公司产品, 其余试剂为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)免疫组织化学方法, 具体操作按试剂说明书进行。以微波枸橼酸盐进行抗原修复, DAB显色, 同时用PBS代替一抗作阴性对照, 用预实验中已知的Hec1表达阳性片作阳性对照。结果判断: Hec1以细胞核染成淡黄或棕黄色为阳性, 在400倍光镜下观察20个视野, 每个视野计数200个细胞, 阳性细胞数记分: lt5%为0分, 5%～25%为1分, 26%～50%为2分, 51%～75%为3分, gt75%为4分 染色强度记分: 淡黄色为1分, 黄色为2分, 棕黄色为3分 组织化学积分(两记分的乘积): gt1为阳性, ≤1为阴性。 　　1.2.2 Western blot检测 按1∶5（质量/体积）的比例加入组织裂解液, 含7 mmol/L尿素, 20 mL/L Triton X100, 40 mmol/L TrisHC1, pH8.0, 100mg/L PMSF, 1mg/L Aprotinin, 40mmol/L DTT和去离子水, 置于冰上, 将组织碾碎后放置1.5～2.0 h, 匀浆器匀浆 4℃,12000 r/min离心20 min, 取上清匀浆用Bradford法测定上清液中总蛋白的浓度, 分装于-70℃冰箱备用。将总蛋白煮沸变性10 min, 以50 μg/孔上样, 在120 g/L的SDSPAGE 凝胶中进行电泳分离, 电泳完毕后, 通过电转