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微生物遗传学实验 生命科学学院 闫绍鹏 实验安排 实验一 大肠杆菌质粒DNA的提取 一、实验目的 学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。 获得高质量的质粒DNA，为遗传转化实验提供材料。 二、实验原理 质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。 从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤： 1、? 培养细菌使质粒扩增 2、? 收集和裂解细菌 3、? 分离和纯化质粒DNA 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾缓冲液，恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍能保持在一起，因此复性迅速而准确。 而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、实验材料、主要仪器及试剂 1．材料 含质粒的E.coli。 2．主要仪器 超净工作台、低温离心机、恒温水浴、微量移液器、培养箱、摇床、凝胶成像系统、琼脂糖凝胶电泳系统等 3．主要试剂 （1）溶液Ⅰ 50 mmol／L葡萄糖＋25 mmol／L Tris·HCl（pH值8.0）＋10 mmol／L EDTA（pH值8.0），121℃ 15min灭菌后4℃保存。 （2）溶液Ⅱ 0.2mol／L NaOH＋1％SDS（pH值12.6）。 （3）溶液Ⅲ 5mol／LKAc 60ml＋冰乙酸11.5ml＋水28.5ml（pH值4.8）。 （4）LB培养基（液体、固体） （5）氯仿／异戊醇（24：1） （6）70％乙醇及无水乙醇 、灭菌水 四、实验方法及步骤 电泳检测 1．将有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好 (一定封严，不能留缝隙)。 2．将有机玻璃内槽放置于水平位置，并放好样品梳子。 3．将称取0.2g琼脂糖 放入三角瓶中，加入 25mL 1×TAE，用封 口膜封住三角瓶的上 口，在微波炉中将琼 脂糖溶化。 4. 待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入5μL EB核酸染料，轻轻混匀，将混匀的胶液缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 (注意不要形成气泡)。 5．待胶液凝固后，取下橡皮膏，将机玻璃内槽放入电泳槽内。加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中使缓冲液刚好没过胶平面，轻轻取出梳子。 6. 加样：DNA样品中按照10：1的比例添加10×凝胶加样缓冲液(loading-buffer)，混合均匀,用移液枪将DNA样品加入样品孔中。(记录点样顺序及点样量)。 五、实验结果 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA的转化 一、实验目的 通过实验了解原核生物实现基因转移和重组的途径，掌握质粒DNA转化实验的基本原理和操作方法。 二、实验原理 目前应用较广的转化方法主要为2种：CaCl2转化法（化学转化法）和电转化法。 感受态（Competence)： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态 转化（transformation)： 异源DNA分子导入受体细胞的过程 致敏过程: 用理化方法诱导细胞进入感受态的操作 细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热激处理,促进细胞吸收DNA复合物 复苏：细菌在非选择性培养基上保温一段时间，使抗性的表型表达后再转到含抗性的选择性培养基上，长出来的菌落即为转入了外源基因的菌落 电转化法则是依靠短时间的电击促使DNA进入细胞。另外还有其它转化方法，比如大肠杆菌（E.coli）HB101菌株在－70℃下与DNA混合后反复冻融，就可以得到转化子，其效率与CaCl2转化法相近。 本实验通过CaCl2转化法将pETBlue-2-AKP质粒转化入大肠杆菌NovaBlue菌株中。 蓝白斑筛选原理 α互补：E.coli β-半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。 载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有