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《细胞工程》实验讲义 泰山学院生物科学与技术系 2011年10月目 录 实验一 实验器械、器皿的清洗和消毒 2 实验二 细胞培养用液的配制 6 实验三 动物细胞原代培养技术 7 实验四 动物细胞的传代培养 9 实验五 培养细胞的冻存与复苏 10 实验六 细胞计数 10 实验七 细胞成活率测定 11 实验一 实验器械、器皿的清洗和消毒一、实验目的 掌握细胞培养所需器械、器皿的清洗和消毒方法。 二、实验用品 1、玻璃器皿： 移液管、指管、离心管、培养瓶、100ml玻璃瓶、250ml玻璃瓶、培养皿、大橡皮塞、培养瓶盖、过滤器。 2、实验器械： 眼科剪、眼科镊。 3、仪器： 超净工作台、干燥箱、高压锅、烘箱。 4、试剂： 75%酒精、1‰新洁尔灭、高锰酸钾、重铬酸钾、浓硫酸。 三、实验方法 （一）清洗 1玻璃器皿的清洗 组织细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求透明、无污迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅残留百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此清洗质量的好坏直接影响到细胞培养成功与否，必须严格按照清洗的程序进行，以保证达到清洗的目的。一般玻璃器皿清洗的程序包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。 （1） 浸泡 初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或溶解，培养后的玻璃器皿往往粘有大量蛋白质，干燥后不易刷洗掉，故用后立即浸入清水中，注意让水完全进入瓶皿中，不应留有气泡。 新的玻璃器皿表面常附着灰尘，同时在生产过程中，玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。新瓶皿使用前应先用自来水简单刷洗，然后用稀盐酸溶液（5%）浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。 （2） 刷洗 浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以去除器皿表面附着较牢的杂质。刷洗玻璃器皿易用软毛刷和优质洗涤剂（如高级洗衣粉和洗洁精），绝对不能使用含沙粒的去污粉，注意特别要刷洗瓶角部位。 （3） 浸酸 刷洗不掉的微量杂质经过浓硫酸和重铬酸钾清洁液的强氧化作用后，可被除掉，而且对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。清洁液是由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成。浸泡时，器皿要充满清洁液，勿留气泡。浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。 清洁液一般可配制三种强度，配方如下： [强液]重铬酸钾63g 浓硫酸1000ml 蒸馏水200ml [次强液]重铬酸钾120g 浓硫酸200ml 蒸馏水1000ml [弱液]重铬酸钾100g 浓硫酸100ml 蒸馏水1000ml 配制清洁液时，应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙。注意保护好面部和身体裸露部分。配制过程中，可使重铬酸钾溶于水中（有时不能完全溶解，可加热溶解重铬酸钾）。待重铬酸钾溶液冷却后，慢慢加入浓硫酸（工业用酸即可）。注意！只能将浓硫酸缓慢加入水溶液中，若注入过急产热量大，易发生危险，切忌反向操作，以免浓硫酸溅出伤人。配制容器应用陶瓷或耐酸塑料制品。配成后的清洁液呈棕红色，经长时间使用后，因有机溶剂和水分增多渐变成绿色，表明已失效，应重新配制。旧清洁液仍有腐蚀作用，严禁乱倒，宜深埋土中。 （4） 冲洗 刷洗和浸酸后都必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。冲洗宜用洗涤装置，以保证冲洗效果，省时省力，亦可用手工操作，但每瓶都得用水灌满，倒掉，重复十五次以上，最后再用蒸馏水漂洗2～3次，凉干备用。 2橡胶制品的清洗 组织细胞培养中所用橡胶制品主要是橡胶塞、圈以及滴管头等。新购置的橡胶制品带有大量滑石粉应先用自来水冲洗干净后，再作常规清洗处理。常规处理方法是：每次使用后的橡胶制品都要置入水中浸泡，以便集中处理和避免附着物干涸，然后用2%NaOH液煮沸10～20分钟，以除掉培养中的蛋白质。自来水冲洗后，再用1%稀盐酸浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水各冲洗2～3次，凉干备用。 3塑料制品的清洗 目前组织细胞培养使用的塑料器皿主要是进口的，是一种经过消毒灭菌密封包装的商品。用时，打开包装即可，是一次性使用物品。必要时，用后经过无菌处理后，尚可反复使用2～3次，但不宜过多。再用时仍然需要清洗和灭菌处理。塑料器皿质地软，使用后应即刻浸入水中严防附着物干涸，不宜用毛刷刷洗，以防划痕出现，如残留有附着物可用脱脂棉轻轻擦拭，用流水冲洗干净，晾干，再用2%NaOH液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，然后用5%盐酸溶液浸泡30分钟，随后用自来水冲洗干净，再用蒸馏水漂洗5～6次，晾干备用。 4金属器具的清洗 组织细胞培养所用金属器具主要是一些手术刀、剪、镊子、针等，这些器具使用后应立即用酒精擦洗干净，晾干后备用。 （二）包装 包装的目的是防