介导穿孔素短发夹RNA 重组腺病毒的构建及其生物学作用.docVIP

介导穿孔素短发夹RNA重组腺病毒的构建及其生物学作用 赵莉琳1， 刘阳2（1、重庆医科大学附属第一医院口腔科 400016；2、重庆医科大学附属第二医院耳鼻咽喉－头颈外科 400010） 摘要:目的：本研究采用腺病毒介导的RNAi技术对穿孔素的功能进行体外研究，以阐明短发夹RNA重组腺病毒可以影响NK-92细胞中穿孔素的表达。方法：构建腺病毒介导的穿孔素shRNA，在mRNA和蛋白水平验证所构建的重组腺病毒的有效性，最后通过转染Ad-shPFP对NK-92细胞穿孔素蛋白表达水平产生影响。结果：转染pShuttle-Scramble和pShuttle-shPFP1～3的干扰效率分别为(4.4±1.2)%，(74.2±4.1)%， (43.2±3.2)% 和(61.7±2.6)%。干扰组与对照组的差异明显，其中又以pShuttle-shPFP1的干扰效果最佳。RT-PCR检测mRNA表达：Ad-shPFP1处理组的mRNA与之相比值为0.32，表明在腺病毒介导下，shRNA使得NK-92细胞中穿孔素mRNA水平减少。western blot免疫印迹分析，用Ad-shPFP1处理后可在蛋白水平上明显抑制穿孔素基因的表达。结论：穿孔素短发夹RNA重组腺病毒可以在mRNA和蛋白水平抑制NK-92细胞中穿孔素的表达。 关键词：穿孔素 腺病毒 NK细胞 短发夹RNA ZHAO Li-lin1, Liu Yang2(1 The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Dental 2 Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University Otolaryngology - Head and Neck Surgery Chongqing 400015 ) Abstract: Objective In this study, adenovirus-mediated RNAi technology was applicated on the function of perforin in vitro studies, to elucidate whether Recombinant adenovirus can affect the expression of Perforin in NK-92 cells. Methods Constructed Adenovirus-mediated perforin shRNA, the validity of the constructed recombinant adenovirus was verificated at mRNA and protein levels. With the transfection of Ad-shPFP into NK-92 cells, the expression of perforin protein was detected . Results the jamming rate of transfection pShuttle-Scramble and pShuttle-shPFP1～3 are (4.4±1.2)%，(74.2±4.1)%， (43.2±3.2)% ,(61.7±2.6)%. Morover，RT-PCR shows the ratio of Ad-shPFP1 and pShuttle-shPFP1 is 0.32. Furthermore Western blot shows after Ad-shPFP1 can obviously inhibit the expression of Perforin. Conclusions Recombinant adenovirus with perforin shRNA can repress the expression of Perforin in NK-92 cells. Key words: perforin; adenovirus; NK cell; short hairpin RNA 获得性免疫相关的细胞毒性T淋巴细胞( Cytotoxic T Lymphocytes）和NK细胞（Natural Killer cells）介导的细胞杀伤对清除肿瘤和病毒感染细胞起着至关重要的作用[1]。其中，穿孔素/颗粒酶通路又扮演着重要角色[2]。在人的CTL和NK细胞中一共有5种颗粒酶（分别是A, B, K, M, H），它们能在穿孔素（Perforin）的帮助下，进入肿瘤细胞，进而起到杀伤肿瘤细胞的作用[3,4]。目前的研究表明，穿孔素对杀伤作用是有着决定性的。