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第七章 生物大分子的色谱分离和纯化 分离方法 从现在分离科学理论计算得出，色谱和电泳是目前所知最好的两种分离方法，其理论塔板数可达百万数量级。 但是，因受各种因素的限制，电泳目前尚不能用于生产规模的生物大分子的分离纯化，这就是人们把分离和纯化生物大分子（包括蛋白质、酶、核酸和多糖等，以下简称蛋白）的研究重点放在色谱上的原因。 纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。 色谱分类(按照进样量) 1、分析色谱（10mg） 2、中等规模制备色谱或半制备色谱（10-50mg） 3、制备色谱（0.1-1g） 4、工业生产规模色谱（大于20g/d） 第一节 基本理论 一、计量置换保留理论 (1)溶质计量置换吸附理论。 它的核心是，当一个溶质被吸附剂吸附时，在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子。 （2）计量置换保留理论 二、有效柱长和最短柱长 液相色谱（LC）分离小分子溶质时，从理论上讲，色谱柱愈长，分离效果愈好，但因其长度受到色谱仪提供的压力的限制，色谱柱不可能无限度长。在实际应用中，一般认为色谱柱的长径比为10，是色谱柱较为合适的几何比例。 生物大分子而言，它的保留主要是流动相中，置换剂的浓度决定的，柱长对生物大分子的分离几乎没有影响，有时甚至会出现短柱比长柱分离效果还好的情况。 第二节 装置和操作技术 1、无论是用什么类型或者用于什么目的的色谱，其装置均包括流动相供给、进样、色谱柱和检测器4大部分。 2、在色谱过程中，有两种将目标产品从色谱柱洗脱下来 的方法，一种是维持流动相热力学参数不变的等梯度洗脱法(如温度、浓度和pH等参数不变）；另外一种是改变其中一种或者几种热力学参数的梯度洗脱法（如增大流动相中某些组分的浓度使溶质从柱上洗脱）。 第三节 色谱条件及色谱纯化工艺的最优化 这是一项涉及学科面广，与色谱和现代分离科学乃至基础理论密切相关的一门复杂的学问。 单纯从每一步和色谱分离最优化条件来讲，它涉及固定相（包括种类、颗粒和孔径大小）、流动相、柱尺寸、流速、洗脱方式、质量回收率和活性回收率等每一种参数的最优化选择 接着便是将这些参数综合在一起的色谱条件最优化研究。 最后，便是将各步分离纯化串在一起组成一个完整的蛋白纯化工艺。有时甚至连同发酵工艺一起来进行生产工艺的优化选择。 在色谱单元纯化条件的最优化中，首先解决的问题是要对所用色谱柱的种类进行选择，这取决于试样和目标产物的性质。一般来说，期望目标产品尽可能多的保留，而杂蛋白不保留，因此需选择目标产品与固定相作用力强、廉价的色谱柱。 1、选择填料 2、填料颗粒、孔径及柱尺寸的大小。 3、流动相 4、流动相组成、流速和梯度洗脱方式 5、选定几种不同色谱的最优化条件，将这些单元进行组合以得到最佳分离和纯化工艺。 成本和分离条件的选择 E=P/t 第四节 蛋白的色谱复性及同时纯化 作为高效分离手段之一的LC是纯化蛋白质的一种最有效方法，已成为基因重组蛋白质纯化必不可少的手段。 一、各种液相色谱的蛋白质复性方法 LC法进行蛋白质复性的优点是： 1、进样后可很快除去变性剂 2、色谱对于蛋白质分子的吸附，提高了复性的质量和回收率 3、复性同时达到纯化目的 4、便于回收变性剂，以降低废水处理成本 该法的复性机理为： 在变性蛋白进入柱顶端时，因有高浓度变性剂的存在，变性蛋白质分子有一个随机的构象状态和大的动力学水和半径，不能进入柱的空隙，蛋白质在SEC柱上不保留。当受到复性的缓冲溶液洗脱时，因其逐步取代变性剂并使蛋白质浓度降低，使变性蛋白质分子处于热力学不稳定的高能状态，这些蛋白质分子就会自发地向热力学稳定的低能态-即蛋白质的天然状态转化，从而使变性蛋白质开始复性。 此时，局部复性的蛋白质可以进入球的内部，开始在液-固两相间进行分配，随着时间的推移，当蛋白质分子的结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐步增加。当蛋白质进入柱填料的空隙后，其扩散速度缓解，从而限制了蛋白质的聚集，这样就减少了沉淀的产生。 蛋白质分子大，先从柱上洗脱下来，变性剂分子质量小，最后流出色谱柱。 2、IEC--离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography） 其复性机理与SEC不同之处在于变性的蛋白质与固定相间有分子间的电荷作用，这种作用力可导致变性的蛋白吸附于固定相表面，在洗脱过程中进行吸附-解析-再吸附的复性。 3、 AFC--亲合色谱（Affinity Chromat