第二章细胞生物学研究方法.pptVIP

（四）高压电子显微镜high voltage electron microscope （五）原子力显微镜 atomic force microscope 2. 移动区带离心法 moving-zone centrifugation 用于体积差别较小的颗粒的分离 制备有密度梯度的离心介质。介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 （三）、激光捕获显微切割技术 laser capture microdissection 在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上，红外激光熔化膜，膜与组织在目标位置牢固结合，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上。 五、细胞培养技术 cell culture 基本条件： 营养 环境 支持物 一、其他的一些分离技术（一）层析技术 chromatography 层析技术亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 七、绿色荧光蛋白 green fluorescent protein 绿色荧光蛋白(GFP)是一类生物发光蛋白，由238个氨基酸组成，是典型的β桶形结构，包含β折叠和α螺旋，将荧光基团包含在其中，防止它被周围环境淬灭。 当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。 十一、基因芯片技术 gene chip 基因芯片的原理是杂交测序法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。 由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析。通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。 十二、RNA干扰技术 RNA interference RNAi是由dsRNA介导的同源RNA降解过程。转录后基因沉默、共抑制及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。 使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 细胞生物学研究的一般策略 1. 提出问题 2. 选择模式生物和生物分子组分 3. 细胞内定位并测量浓度、活性和组成成分 4. 鉴定生物分子的作用途径和作用参数 5. 纯化生物分子并重建该细胞生物学过程 6. 测试其生理学功能并构建模型 对细胞生物学研究中方法和技术的基本认识 了解并掌握不同方法的原理和适用范围，实际研究中，要根据研究问题，设计巧妙、经济、简洁的实验方案 六、原位杂交技术 in situ hybridization 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。 在不破坏组织和细胞的原有结构和不提取核酸的情况下，显示组织细胞中特定的低含量的核酸序列。 原位杂交原理 人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 用于研究靶蛋白在活细胞内的位置及动态变化及定量测定与分析。 细胞膜上绿色荧光蛋白标记TGF-βII型受体的单分子图像 八、PCR 技术 聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）扩增技术，即体外试管内DNA的扩增，以高特异性、高灵敏度、高效率及忠实性等特点，在生命科学研究领域产生着巨大的影响。 其原理类似于DNA在体内的复制过程，利用DNA半保留复制的原理，使模板DNA、引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，经过变性、复性和合成的反复循环，达到体外快速扩增特异性DNA片段的目的。 PCR原理 九、Southern印迹杂交技术 是体外分析特异DNA序列的方法，用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 十、Northern印迹杂交技术 检测特异性RNA的方法，原理与操作类似Southern印迹杂交。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 （三）扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM 根据