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基因工程实验教案 已知的原核基因的克隆和表达 实验一 基因工程试验基础操作 实验二 基因组DNA提取和电泳检测 实验三 目的基因分离和扩增 实验四 目的片段回收和DH5α感受态制备 实验五 转化和阳性克隆的筛选 实验六 重组质粒鉴定（酶切和PCR） 实验七 目的片段回收和BL21感受态制备 实验八 转化和重组子筛选 实验九 重组子鉴定（酶切和PCR） 实验十 诱导表达和样品的制备 实验十一 SDS 开放实验，克隆和表达一个已知的原核基因 实验十二 ——实验十八 基因工程实验教案 已知的原核基因的克隆和表达 实验一 基因工程试验基础操作 主要讲解内容：克隆流程、注意事项、实验安排 1、培养基制作、各种溶液配制、 实验二 基因组DNA提取和电泳检测 主要讲解内容：基因组DNA提取方法和步骤 准备： 提前培养大肠杆菌用于提取DNA 提取缓冲液、DNA电泳缓冲液配制 实验三 目的基因分离和扩增、目的片段回收和 主要讲解内容：PCR引物，所用引物为什么这样设计，T载体、表达载体、多克隆位点 回收的方法，为什么要回收，最好是PCR完成后就回收 主要实验：PCR、电泳检测、目的片段回收 准备： PCR管等灭菌 PCR程序（用大体系） 回收的各种试剂 实验四 DH5α感受态制备和连接反应（感受态做两份要留给下一次） 主要讲解内容：感受态制备、连接反应（在下次试验的前天晚上做连接接） 主要实验：感受态制备、感受态制备的细胞放入-80度冰箱保存 准备： 提前准备回收的各种试剂 细胞提前活化（前一晚上） 实验五 转化和阳性克隆的筛选 主要讲解内容：转化、阳性克隆的筛选的策略（蓝白斑、抗性基因） 主要实验：转化、涂布平板（加抗生素、X-gal、）、(第二天挑选阳性克隆、提取质粒电泳、包括表达载体PET菌的活化和质粒提取，课后学生自己做) 准备： 1. 提前准备回收的各种试剂 实验六 重组质粒鉴定（酶切和PCR） 主要讲解内容：酶切鉴定的原理、PCR鉴定的原理 主要实验：酶切反应包括PET载体酶切留着下次用，PCR反应，电泳检测（学生课外做） 准备： 1. 提前准备各种试剂 实验七 目的片段回收和BL21感受态制备 实验八 转化和重组子筛选 实验九 重组子鉴定（酶切和PCR） 实验十 诱导表达和样品的制备 实验十一 SDS 开放实验，克隆和表达一个已知的原核基因 实验一 基因工程试验准备 实验内容提纲： 主要讲解：整个基因工程试验目的和流程、实验准备（培养基制作、菌种活化、药品配制） 实验室安全常识（禁食，安全防护，废弃物处理），药品性质（危害，毒性，正确使用方法），存放条件及紧急突发事故的处理（烧伤，化学腐蚀，中毒，火灾）； 禁食； 废弃物处理： （1）废弃的培养基，需用消毒液浸泡30min以上； （2）致病菌培养基需高压灭菌后废弃。 3、化学药品火灾处理： 就近用水稀释药剂，防火，若出现明火，脱离火场，报警并报告老师。 实验仪器的安全操作及简单维护；（电路检查，重点：电炉、烘箱、离心机的使用、观看教学片。） 基因工程实验整体安排 目的是克隆和表达一个原核基因 溶液配制方法、基因组提取溶液、质粒提取溶液配制、琼脂糖电泳液配制 培养基的配制[每组固体培养基4瓶（150ml）、液体培养基30支5ml、5瓶50ml] 菌种的活化、标记、清洁工作 各种需要的培养皿、枪头、EP管灭菌等 注意克隆载体、表达载体、不同基因型大肠杆菌 原核基因克隆简要流程： 原核基因克隆详细流程： 实验二 基因组DNA提取和电泳检测 一、实验目的 掌握细菌染色体DNA的常规制备方法，要求学会根据不同实验需求选择不同实验方法。 二、实验原理 （见书p19，以此法为准） 基因组DNA抽提的基本原理 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。 不同生物（植物、动物、微生物）的基