色谱法本科生教学中文版.pptVIP

生物化学实验教学 实验内容： 1.生物化学常用四大技术（分光光度法－血糖测定，蛋白定量分析；色谱法－离子交换色谱和凝胶色谱；电泳法－醋酸纤维薄膜电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳；离心－质粒DNA的小量快速制备中使用） 2.GPT酶活性测定 3.过氧化氢酶Km值测定 4.酶竞争性抑制 5.实验操作考试 6.课堂讨论及课堂答疑 色谱法 第一节 概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法（chromatography)。又称层析法。 第一节 概述 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相 ；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相 ；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱 。 第一节 概述 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 第一节 概述 色谱法是利用混合物中各组分的理化性质的差异（吸附力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力等），使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相叫固定相（stationary phase），另一相流过此固定相叫做流动相（mobile phase）。由于各组分受流动相作用产生的推力和受固定相作用产生的阻力的不同，使各组分产生不同的移动速度，从而使结构上只有微小差异的各组分得到分离。 第一节 概述 特点： 1．具有极高的分辨效力：同系物、同分异构体，甚至同位素。 2．具有极高的分析效率：HPLC(high performance thin layer liquid chromatography)一次仅10分钟就可完成40个样品的点样和分析工作。 3．具有极高灵敏度：样品组分含量仅数微克，或不足一个微克都可进行很好的分析。 4．操作简便，应用广泛： 第一节 概述 从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。 第一节 概述 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。 第一节 概述 2. 按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。 第一节 概述 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。 将具有生物学活性（如酶、辅酶、抗体等）的配位基，键合到载体或基质表面形成固定相。利用蛋白质或生物大分子与亲和色谱固定相配位基的亲和力进行分离的色谱法，称为亲和色谱法。 第一节 概述 3. 按操作形式不同分类 柱色谱法：固定相装于柱内的色谱法。 平面色谱法：色谱过程在固定相构成的平面层内进行的色谱法，包括纸色谱法、薄层色谱法和薄膜色谱法。 第二节 常用的色谱方法 一、离子交换色谱（ion exchange chromatography） （一）基本原理： 利用不同的生物大分子的带电部分与 具有相反电荷的离子交换剂吸附强弱不同，经过强弱不同的洗脱剂进行洗脱从而达到分离目的。 一、离子交换色谱（ion exchange chromatography） 离子交换剂： 藉酯化、氧化或醚化等化学反应在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上引入阳离子或阴离子基团的特殊剂型。当离子交换剂带阳离子基团时，可吸附阴离子样品称为阴离子交换剂，如DEAE。反之，离子交换剂带阴离子基团时，可吸附阳离子样品称之为阳离子交换剂，如CM。 一、离子交换色谱（ion exchange chromatography） 阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子进行交换。例： R—SO3－H+ + Na+←→R—S O3 Na+ + H+ 阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换。如： R—NH4＋ OH－+Cl－←→R—NH4+ Cl－+OH－ Ion exchanger An ion exchanger consi