实验六小鼠骨髓细胞染色体的制备与C带染色.pptVIP

实验六 小鼠骨髓细胞染色体的制备与C带染色 1.实验目的 理解染色体标本制作的应用。 掌握滴片法制作动物细胞染色体的一般方法。 学会细胞的收集、低渗和洗涤等基本方法。 学会小鼠骨髓细胞染色体C带的制备。 2. 实验原理 低渗使细胞膨胀，染色体松散；高空滴片时染色体进一步完全散开；再通过冷热处理，使细胞膜及核膜破裂，这些步骤都有利于观察到好的动物细胞染色体标本，是实验中的关键步骤。 染色体的显带是细胞学的一项重要技术，借助特殊的染料及染色程序，使染色体的一定部位呈现深浅不同的染色带纹。可用来鉴别染色体组、单个染色体以及深入认识染色体的结构与功能。 染色体的C带染色 C带是显带技术中最简单的一种带型，C带为结构异染色质带的简称。C带可使着丝粒区、端粒区的异染色质及其他染色体区段的异染色质部分呈Giemsa深染，其他部分呈淡染。 C带染色前制备的染色体需经老化，造成染色体DNA的选择性降解。在酸、碱、盐的处理过程中, 由于异染色质包装比较紧密，特别是具有高度重复DNA序列的部分较少受到酸、碱、盐破坏，Giemsa染色呈深染；而常染色质区的DNA序列易受到酸、碱、盐的破坏，所以Giemsa染色呈淡染。 3.实验材料、用品 仪器 光学显微镜，冰箱，恒温水浴锅。 材料 已制备好的小鼠（雌雄各半）骨髓染色体载玻片，染色缸，烧杯，镊子等。 试剂 盐酸(0．2mol/L)；5%Ba(OH)2（50℃预热）；，2×SSC溶液（60—65℃预热）：将17.53g NaCl和8.82g的柠檬酸钠溶于1000ml的蒸馏水中；Giemsa染液。 4. 实验步骤 （1）滴片法制备染色体 a 选择体重20g左右的健康小鼠，在实验前2-3h，按2-4μg/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素。 b 用颈椎脱臼法处死小鼠，将其置于解剖板上，取出后肢完整的股骨（从髋关节至膝关节），然后剔除肌肉、肌腱，用生理盐水洗净。 c 剪去股骨两端，用带6号针头的注射器吸入1 ml低渗液，插入骨髓腔1/2部位，然后将股骨浸入含0.85%生理盐水的离心管内，反复冲洗骨髓细胞到刻度离心管内，直至骨髓腔呈白色为止（注意：动作要轻，否则很容易使细胞破裂，导致染色体丢失）。然后换4号针头轻轻抽打离心管内的细胞，尽可能使其分散。 d 以1000r/min离心8min，弃去上清。 e 向细胞中加入5ml在37℃预热的0.075mol/L KCl低渗溶液，用吸管轻轻抽打均匀，置37℃恒温水浴锅内，低渗处理15-30min（使细胞膨胀）。 4.实验步骤 f 沿离心管壁缓慢加入1ml新配制的固定液预固定，以1000r/min离心8min，弃去上清。 g 加入新配制的固定液固定20min。离心去上清。如此反复固定2—3次， 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量新配制的固定液0.3-0.5ml，将细胞团块轻轻吸打成悬液。 i 用吸管在干净、湿、冷的载玻片上滴2～3滴（不要重叠）上层细胞悬液，然后顺载玻片斜面用口轻轻吹散，在酒精灯上文火烘干（在空气干燥的地方可晾干或用吹风机吹干）。 j 将玻片标本平放于支架上，细胞面朝上，每片滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液3～4滴，染色10min。 k 在自来水管下细流冲洗数秒，去掉Giemsa磷酸盐缓冲液，用小块纱布擦干玻片标本底面和四周。 l 将标本置于显微镜下观察和分析。先用低倍物镜找出分散好的分裂相视野，再换高倍物镜和油镜观察。注意标记好标本的雌雄。 4. 实验步骤 (2) C带染色 将老化3-7 d的染色体标本在室温下用0.2mol/L的盐酸处理1 h。 用蒸馏水轻轻冲洗3次。 转入50℃ 5% Ba(OH)2溶液中温育12 min左右。 立即用自来水冲洗2min，再用温蒸馏水冲洗2次，使Ba(OH)2被冲洗干净。 将标本放人60-65℃ 2×SSC溶液中处理1 h。 用蒸馏水轻轻地冲洗载玻片，空气干燥。 染色：用Giemsa染液染色5-8 min。 用自来水轻轻地冲洗，空气干燥或电吹风吹干。 镜检：先用低倍物镜找出分散好、C带反差好的分裂相视野，再换高倍物镜和油镜观察，应看到C带区为深染，非C带区为浅染 5.实验结果 6. 注意事项 要掌握好低渗的时间、滴片的高度、及其热胀冷缩的步骤，可在实验中多设置几个条件作对照，以找出最为恰当的处理方法，保证染色体分开，清晰且完整。 因老化、酸、碱和盐处理过程中都要损失一些细胞，所以骨髓细胞滴片时要多滴一些细胞，各步清洗都要轻些，否则将冲掉很多细胞。 必须严格控制老化的时间和温度，否则C带区和非C带区染色后的反差较小，分辨不清。实验老化7 d过程中，骨髓细胞滴片先在4℃冰箱中放置4d，再于室温（20℃左右）下放置3 d，C带染色效果较好。 7.思考题 动物