实验三灭菌前准备及培养基的制备.docVIP

课程名称：微生物学检验技术 授课专业：医学检验 学时：2学时 实验三 培养基的制备及灭菌前准备 一、实验目的 1.掌握培养基的制备； 2.熟悉灭菌前的准备工作。 二、实验物品 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水，三角烧瓶，天平，玻棒，烧杯， 电炉，PH试纸等 三、实验内容 ㈠ 培养基的主要成分 1．营养成分：蛋白胨，牛肉膏，糖、醇类，血液，鸡蛋、动物血清，无机盐类生长因子 2．水分 3．凝固物质：琼脂 4．抑制剂：选择培养基 5．指示剂：鉴别培养基 ㈡ 培养基的分类 1.按用途分 ⑴基础培养基：普通肉汤，普通营养琼脂平板 ⑵营养培养基：血平板，血清肉汤 ⑶鉴别培养基：糖发酵管，生化反应管 ⑷选择培养基：SS，EMB，麦康凯 ⑸增菌培养基：多为液体，如葡萄糖肉汤，具有选择性抑制 2.按物理形状分，取决于琼脂含量 ⑴液体培养基 ⑵半固体培养基：琼脂量3～5克/升 ⑶固体培养基：琼脂量20～25克/升 ㈢培养剂的制备程序： 1.调配：先在三角烧瓶中加入少量蒸馏水，按培养基的配方准确称量各种成分，混悬于三角烧瓶的蒸馏水中，再加入蛋白胨等各种成分，以防其粘附于瓶底，然后再以剩余的水冲洗瓶壁振摇混匀。但有些物品，如染料、指示剂、胆盐等在矫正PH后方可加入。 2.熔化：将各种成分混匀于水中，在电炉上溶解，应随时搅拌，如有琼脂冲成分应防止外溢。注意补足失去的水分， 3.矫正PH值：用精密PH试纸矫正培养基的PH，一般培养基的PH矫正至7.4～7.6，高压蒸汽灭菌后可降低0.1～0.2。（本实验室使用NaOH矫正） 方法：取一支试管加入培养基5ml，用精密PH试纸测其PH值，若测定试管中的培养基过酸或过碱（多为偏酸，可用0.1MOL /L的NaOH或0.1MOL /LHcl校正，加酸或是加碱时要缓慢、准确，每加一滴后要充分摇匀，比色后在加一滴直至PH达到7.4～7.6，准确记录加入的量。 为防止培养基中因矫正PH而加入过多的水，可将0.1MOL /L的NaOH换算成1MOL /L的NaOH，培养基中加入所需NaOH后，充分混匀，再测1次，如仍未达到所需的PH，再按上法矫正。 计算：设5ml培养基矫正PH需0.1MOL /L的NaOH0.15ml，现配置培养基1000ml，需加NaOH量为： 5:x =0.15:x X=30 如为1MOL /L的NaOH，则需3ml 4.过滤澄清 5.分装：量不超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。 ⑴半固体培养基：分装量为试管的1/3 ⑵液体培养基：分装量为试管的1/3 ⑶琼脂斜面：分装量约为试管的1/4，斜面长度约为试管长度的2/3 6.灭菌：高压蒸汽灭菌法 7.检定：无菌试验，效果检查 8.保存：注明名称和日期。 ㈣注意事项 ⑴调配称量要准确； ⑵溶化完毕要补足水分，溶化时选择玻璃容器、搪瓷、不锈钢也可，勿用铜、铁，会影响细菌生长 ⑶PH准确测定：溶液热时可降低PH值，故须溶液冷却后测定矫正；固体与半固体培养基矫正PH后，在加琼脂。 ⑷培养基必须保持澄清 ⑸分装不宜超过容器的2/3； ⑹高压灭菌时间不宜太长，否则培养基变质，琼脂沉淀 ⑺培养基配置后，无菌实验效果检查合格后方可使用 ⑻要注意标记名称和制备日期。 ㈤灭菌前的准备 三角烧瓶的包扎；平板的包扎；吸管的包扎 四、实验安排 每2人一小组分别进行： 第一台配制肉膏汤，每小组200ml 配方：牛肉膏0.3～0.5g　 蛋白胨 1g　 NaCl 0.5g　 　 蒸馏水100ml 第二台配制半固体培养基，每小组100ml 配方：肉膏汤100ml　琼脂0.3～0.5g 第三台配制固体培养基，每小组100ml 配方：肉膏汤100ml　+　琼脂2～3g 五、实验准备： 牛肉膏：3瓶/教室 蛋白胨：3瓶/教室 NaCl： 3瓶/教室 琼脂：3瓶/教室 0.1mol/L NaOH：3瓶/教室 1mol/L NaOH ：3瓶/教室 1mol/L HCl ：3瓶/教室 0.1mol/L HCl ：3瓶/教室 量筒：6个/教室(100-200ml) 烧杯：16个/教室 玻棒：16根/教室 三角烧瓶：16个/教室 包布：16块/教室 胶塞：16个/教室 天平: 3个/教室 电炉：2个/教室 平板：3捆/教室 试管：16支/教室*3 5ml吸管（长）： 6支/教室 5ml