实验十一蛋白质的制备.docVIP

实验十一　　蛋白质的制备 ——牛奶中提取酪蛋白 一、目的 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。掌握用酸性溶剂使蛋白质的pH值发生变化而利用等电点沉淀法制取蛋白。 二、原理 蛋白质是由氨基酸构成的高分子化合物。蛋白质同氨基酸一样是两性电解质，调节蛋白质溶液的pH值可使蛋白质分子所带的正负电荷数目相等，即溶液中的蛋白质以兼性离子形式存在，在外加电场中既不向阴极也不向阳极移动。这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。在等电点条件下，蛋白质溶解度最小，因此就会有沉淀析出。 三、操作方法 方法一 （1）取牛奶50mL，离心（3 000 r/min）15 min，除去脂层。 （2）向脱脂奶中加入50mL水后用0.5mol/L HCl调整pH到4.6，离心（2 000 r/min） 3 min。 （3）取沉淀加入100mL水并用0.5mol/L NaOH调整pH到7.0，用0.5mol/L HCl调pH到4.6，离心（2000 r/min）3 min mol/L NaOH调整pH到7.5,溶解后装入透析袋中透析48h，即得酪蛋白粗品。 方法二 （1）将50mL牛奶加热到40℃。在搅拌下慢慢加入预热到40℃的pH4.7的醋酸缓冲液50mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷至室温。离心15 min(2 000 r/min)，弃去清液，得酪蛋白粗制品。 （2）用水洗沉淀3次，离心10 min(3 000 r/min)，弃去上清液。 （3）在沉淀中加入30mL乙醇。搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇－乙醚混合液洗沉淀两次。最后用乙醚洗沉淀两次，抽干。 （4）将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。 （5）准确称重，计算含量和得率。 含量：酪蛋白g/100 mL牛乳。 得率＝ 测得含量 ×100％ 理论含量 式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 四、Ⅰ实验器材 （1）离心机 （2）酸度计 （3）磁力搅拌器 （4）玻璃棒 （5）烧杯 （6）容量瓶 （7）移液管 （8）电炉 （9）温度计 Ⅱ材料与试剂 （1）鲜牛奶 （2）0.5mol/L HCl （3）0.5 mol/L NaOH （4）95％乙醇 （5）无水之醚 （6）0.2mol/LpH4.7醋酸－醋酸钠缓冲液，先配制A液与B液。 A液：0.2 mol/L醋酸钠溶液：称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2 000 mL。 B液：0.2 mol/L醋酸溶液。称取优级纯醋酸（含量大于99.8％）12g定容至1 000 mL。 取A液1 770 mL，B1 230mL混合即得pH4.7的醋酸钠－醋酸缓冲液3 000 mL。 （7）乙醇－乙醚混合液。乙醇：乙醚＝1：1（V／V）。 五、思考题 1．为什么调整溶液的pH值可将酪蛋白沉淀出来？ 2．用有机溶剂沉淀蛋白质的原理是什么？ 3．试述透析法去除酪蛋白中杂质离子的原理。