PEG介导的动物细胞融合技术.docVIP

PEG介导的动物细胞融合技术 实 验 目 的 1. 通过PEG介导的鸡血细胞融合实验, 对体细胞融合有一个清楚的概念 2. 并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术 实 验 原 理 1.方法： 病毒(Okada, 1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)(Pontecorvo, 1975)和电激(Zimermann, 1980s)。 2.原理： 一方面PEG改变各类细胞的膜结构，使细胞相互接触部位的膜磷脂分子发生疏散、结构发生重排；另一方面膜脂双层的相互亲合，彼此间存在表面张力的作用。二者共同引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起, 使两胞质沟通，细胞融合。（无完全定论） 3.影响因素： 1)PEG的分子量与浓度:分子量及其浓度越大融合效果越好，但毒性越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。 2) PEG的pH值: pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。 3)PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。 4)融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细胞， 一般采用的温度为38~40℃。 4.材料选择: 1)鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别； 2)实验材料便宜、易得。 实 验 用 品 一、器材 1. 主要设备: 普通离心机、普通光学显微镜 2. 小型器材: 100ml量筒2个, 滴管10支, 10ml刻度离心管20支, 载、盖片各20片 二、材料 新鲜鸡血 三、试剂 1. Alsever液制备 葡萄糖(Glucose) 2.05g 枸椽酸钠 0.8g 氯化钠(NaCl) 0.42g 重蒸水 至100ml 2. 0.85%生理盐水液 3. GKN液 氯化钠 8g 氯化钾(KCl) 0.4g Na2HPO4?2H2O 1.77g NaH2PO4?H2O 0.69g 葡萄糖 2g 酚红(phenolred) 0.01g 溶于1000ml重蒸水中。 4. 50% PEG液 (现用现配) 根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。 实 验 方 法 1. 注射器内先吸入2ml Alsever液, 再从活鸡的翼下静脉抽取鸡血2ml，注入试管内, 再加入Alsever液6ml，使之成为1:4悬液，混匀后放在4℃冰箱中，可使用3~4天。（已做好） 2. 取出上述悬液1ml加入 0.85%生理盐水4ml，混匀后，1200r/min离心5分钟，去上清液后，再以上述离心速率重复离心两次(5min, 10min)，以达到去除细胞表面粘附物质的目的。 3. 去除上清液后，将最后一次离心沉降的血球，加入适量GKN液，使之成10%的细胞悬液。 4. 取上述血球悬液1ml, 加入0.5ml 50%的PEG液混匀，吸取1~2滴, 滴到一干净的载玻片上，在常温下2~3min后即可加上盖玻片进行镜检，并计算出融合率。 实 验 结 果 经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。 细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示： 在实验中统计融合率时, 要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。 作 业 1.计算出细胞融合率。 组别 1 2 3 4 5 6 合计 融合率 视野内融和细胞核数 10 20 8 12 8 6 64 27.2% 视野内细胞核总数 42 59 24 42 33 35 235 2. 本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？ 答：不能。因为植物细胞外有细胞壁，细胞膜不可直接接触，故不可直接用于植物细胞融合。植物细胞融合时应先将细胞壁除去制成原生质体再进行细胞融合。 3. 本实验的材料为什么不用兔子或小鼠的血细胞？如果因实验需要必须选用小鼠血细胞作为实验材料，应如何对融合细胞进行鉴别？请你根据目前所掌握的知识谈谈你所能设想到的鉴别方法。 答：因为兔子或小鼠为哺乳动物，其红细胞无细胞核，细胞融合情况不易观察。 鉴别方法：1.显微镜下观察细胞形态，细胞体积明显偏大或形态表现为正在融合的为融合细胞。 2.将血细胞先分为两组，做不同标记（如用不同放射性元素标记、不同荧光染料、免疫细胞化学染色的二抗采用