RNA抽提到电泳鉴定的实验计划.docVIP

从RNA抽提到电泳鉴定 ——以肌肉组织基因为例 1、RNA抽提 一，准备工作 1，实验器具与材料： 移液枪 吸头 吸头台 EP管 玻璃研磨器 容量瓶 盐水瓶 15ml塑料管一个（配75％乙醇用） 2，实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP管等） 将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC 水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 （2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器） 先泡酸过夜，冲洗干净后，在1‰DEPC水中泡8小时左右，37℃烘干，用蒙锡纸包裹送至干烤3次。 （3） 金属制品：（镊子等） 先洗干净，再送干烤3次。（不需要泡DEPC水） 3，试剂配制和准备： （1） DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4 小时后备用。配75％乙醇的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压。 （2 ） 75％乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制（DEPC水:无水乙醇＝1:3），然后放于-20℃备用。 （3） 异丙醇：放入棕色瓶 （4） 氯仿：放入棕色瓶 （5） Trizol：100ml/瓶 存放于4℃ 二，抽提时注意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩并尽可能在低温下操作，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 三，抽提步骤 1．匀浆化作用 取约100mg动物肌肉组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml 的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块。组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管。 2．分离阶段 每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。 3．RNA的沉淀 将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul ），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20 ℃中1小时，后12000rmp离心10分钟。 4．RNA的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。 5．RNA的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。 注意不能让RNA沉淀完全干燥。再在管中加20ul的DEPC 水溶解，在55-60℃下孵育10分钟助溶。 6，RNA的保存 提取的RNA保存于-70℃超低温冰箱中，或立即用于逆转录。 2、逆转录（RT） 一，准备工作 1，实验器具与材料： 移液枪 吸头 EP管 水浴箱 2，实验器具的处理与准备 将吸头、EP管逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 3，试剂配制和准备： （1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1.5mlEP管中，-20℃中保存备用。 （2 ）RT中所需要的各种试剂 引物、模板RNA、dNTP 、Buffer、逆转录酶、DTT （3）引物浓度计算方法： （新合成的引物的稀释） 假如终浓度为X uM(pmol/ul) 加DEPC水体积（ul）＝（OD×33×1000000）/ （分子量×X） 二，RT时注意事项： 为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。 因为RNA酶广泛存在。 三，RT步骤 用SSⅢ逆转录酶进