农杆菌感受态的制备和转化.docVIP

农杆菌感受态的制备和转化 版本一 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养。 1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16 hr。 1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD600=0.5。 1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。 1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。4℃5000rpm离心5min，去上清。 1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮。 1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200μl冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28℃，175rpm摇培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培养到形成单菌落。 其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。 版本二 普通农杆菌感受态制备与转化： 1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。 2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。 3. 5k rpm离心5分钟。 4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。 5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。 如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。 6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。 7. 液氮中冷冻1分钟。 8. 37℃水浴溶化细胞。 9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。 10. 离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。 11. 涂板，28℃培养2-3天。 版本三 农杆菌感受态细胞的制备 1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28℃、200r/mim培养过夜。 2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为0.5左右。 3.将培养物置冰浴中30min，4℃、5000r/min、离心5min，弃去上清液。 4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl悬浮菌液。 5.4℃、5000r/min，离心5min，弃去上清液。 6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮，分装成50μl／管，液氮中冷冻后至-80℃保存。 农杆菌感受态细胞的制备： 1.试剂配制：solution1 ： Rbcl 1.21g 100mM MgCl2.4H2O 1.02g 50mM K-Acetate 0.29g 30mM CaCl2.2H2O 0.15g 10mM Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。 pH=5.8，121度，高压灭菌30min。 solution2： Rbcl 0.12g 10mM K-Acetate 0.1g 10mM CaCl2.2H2O 1.1g 75mM Glycerol 15% 15ml，定容至100ml。 pH=5.8，121度，高压灭菌30min。 2.农杆菌感受态细胞的培养： 15-20ml无抗生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。（注意牙签和小三角瓶均需灭菌） 3.制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。弃去上清，每管加0.5ml solution1，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g， 离心10min。取出后放在冰上，弃去上清，每管加0.5ml solution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。分装 感受态农杆菌 ，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80℃冰箱中保存。 版本四 1) 从新鲜YEP（5g/LNaCl，10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸出物，10g/L琼脂，50