外周血白细胞RNA提取并RT-PCR实验技术.docVIP

外周血（静脉血）白细胞RNA提取 1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液 ↓ 颠倒混匀，室温放置5min ↓ 3000rpm离心5min ↓ 弃上清。留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次） ↓ 加入1ml Trizol裂解白细胞 ↓ 用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散 ↓ 用5ml注射器反复吹打（不少于10次） ↓ 再用1ml注射器反复吹打 ↓ 加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min ↓ 4℃离心：12000rpm 15min ↓ 转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇（一师兄建议加异丙醇后-80过夜沉淀RNA，-20也可。RNA产出浓度为200-300ng/μl,100μl稀释），混匀，静置15min ↓ 4℃离心：12000rpm 10min ↓ 弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml） ↓ 4℃离心：7500rpm 5min ↓ 弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干 ↓ 将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中 ↓ －70℃冰箱保存，备用 1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置） 2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定 RT-PCR实验 A、RNA逆转录成cDNA（PrimeScriptII 1st Strand cDNA Synthesis Kit）： 1、在灭菌0.1%DEPC浸泡过夜的1.5ml离心管中配制下列混合液 Oligo dT Primer （50uM） 1ul dNTP mixture (10mM each) 1ul ?RNA模板??0.5ug～5ug（根据说明书要求以及RNA浓度计算得到）Taqmix 12.5ul 引物1（上游）（10～20nM） 0.5ul 引物2（下游）（10～20nM） 0.5ul cDNA 2ul（可调整） 超纯水 加至总体积25ul PCR步骤： 1、Hold on 94℃ 5min 2、Cycle 94℃ 40s 3、退火温度： X℃ 40s 4、72℃ 40s repeat “2～4步骤” 5、72℃ 10min 6、4℃ 60min 琼脂糖凝胶电泳 1、1.5g（根据PCR产物片段大小）琼脂糖溶于100ml 1X TBE中，微波炉3min后冷却至60～70℃左右加入5ul EB溶液。 2、待凝胶凝固后移至电泳槽中，负极为上样孔位置，约10ul/孔 3、电压100V 50min（根据分子大小） 4、紫外透射仪上初步观察条带，并使用凝胶成像分析仪拍照储存 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。 异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。 氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用 通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候