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实验九 糖化型淀粉酶活力的测定 一、目的要求 掌握糖化型淀粉酶活力测定的原理和方法。 二、原理 糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。本实验在一定条件下用一定量的酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量，来计算淀粉酶的活力，碘量法测定葡萄糖的原理如下： 首先葡萄糖和碘分子在NaOH的作用下，生成葡萄酸钠。过量的碘和NaOH作用，生成次碘酸钠。 I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O 加酸后，析出游离的碘。 I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI 根据滴定结果计算葡萄糖的含量。 三、试剂和仪器 试剂： 1. 0.05 M 硫代硫酸钠溶液 2. 1 M 碘液 3. 2% 可溶解性淀粉（新鲜配制） 4. 0.1 M NaOH溶液 5. 2 M硫酸溶液 6. 20% NaOH溶液 7. 0.1 醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 4.8) 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)6.7克，又称取冰醋酸2.60 ml, 溶于水并定容至1000 ml, 配制后用pH计校正pH。 器材： 1. 恒温水浴锅 1 只 2. 50 ml烧杯 1 只 3. 玻璃棒 1支 4. 容量瓶 1 只 5. 50 ml具塞试管 2支 6. 滴定管（碱式） 1支 7．漏斗 1只 8. 碘量瓶 4 只 9. 吸管 25 ml 1支 5 ml 1支 2 ml 2支 10 ml 1支 15 ml 1支 0.2 ml 1支 10. 玻璃棒 四、操作 1. 待测酶液的制备 精确称取酶粉2.0克，倒入小烧杯内，用少量pH 4.6醋酸—醋酸钠缓冲液溶解，用玻璃棒搅拌，将上清液小心倾入适当的容量瓶中（容量瓶大小需根据酶活单位决定合适的稀释倍数后选择）沉淀部分再加入少量缓冲液，反复捣研3～4 次。最后将沉渣全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布过滤，样液即为待测酶样。 如为液体样品，可直接过滤，即取一定量的滤液于容量瓶中加缓冲液定容至刻度，摇匀，即为待测之酶液。 2. 测定 于甲、乙两支具塞试管（或比色管）中，均各加入2 ％的可溶性淀粉榕液10ml以及0.1 M pH 4.6醋酸—醋酸钠缓冲液10 ml，摇匀。于50 ℃±0.2 ℃ 的恒温水浴中预热5～10 分钟。然后在甲管中加入特测酶液0.5 ml（在乙管中加人煮沸之酶液0.5 ml )。立即计时，摇匀，在此温度下准确反应10分钟后，立即将甲、乙两管放入沸水中5～10分钟使酶失活、冷却。 取上述反应液5 ml（甲、乙两管各取两支）于4只碘量瓶中，各准确加入0.1M碘液5ml，再各加入0.1 M 氢氧化钠5ml（边加边摇晃），加塞，于暗处效置15分钟，取出后加入2 M硫酸2 ml，用0.05 M硫代硫酸钠滴定至无色为终点。 五、计算 1g酶粉（或1ml酶液）在50℃，pH 4.8 的条件下，催化水解可溶性淀粉在1小时内产生l mg葡萄搪的酶量为一个酶活力单位。 酶活力单位=（B-A）×N ×9.005 ×1/2 ×20.5/5 ×60/10 ×n 其中： B ― 空白（乙管）所消耗的硫代硫酸钠ml数； A ― 样品（甲管）所消耗的硫代硫酸钠ml数；1 / 0.5 — 0.5 ml 酶液折算成l ml； 9.005 — l ml 0.1M 碘液所相当的葡萄糖mg数； 1/2 — 碘与硫代硫酸钠溶液的当量关系； 20.5/5 — 反应液总体积ml数。250 ml取5 ml来测定； 60/10 — 反应时间为10分钟，折算成一小时； n—样品除释倍数； N—碘液的当量浓度。 六、注意 酶液制备时，酶液浓度应控制在消耗0.05 M 琉代硫酸钠（A - B）的差数为1.0～2.0 ml左右。思考题： 1. 用硫代硫酸钠滴定洋品和空白哪一个消耗硫代硫酸钠多，为什么？ 2. 糖化型淀粉酶活力单位是如何定义的？