木瓜蛋白酶的提取.docVIP

木瓜蛋白酶的提取 实验内容与目的 从青木瓜中提取木瓜蛋白酶，用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。通过本实验，掌握天然活性化合物的提取和蛋白质浓度的测定技术。 实验原理 木瓜天然酶 木瓜蛋白酶（papain），简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。他是一种含硫基（—SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，它还具有合成功能，能把蛋白质水解物合称为蛋白质。木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇。氯仿和乙醚等有机溶剂。其最适pH为5.7（一般3~9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适温度为55~60℃（一般10~85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，受还原性物质激活。 木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜（Carica papaya）茎叶和果实中，以未成熟果实的乳汁中为最高。提取未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼可得纯天然生物酶制品。 考马斯亮蓝结合法（Bradford法）测定蛋白质浓度的原理 在一定范围内，考马斯亮蓝G250蛋白复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量关系呈线性关系，故可以用蛋白质浓度的测定。 实验材料 1.材料 青木瓜 2.试剂 氢氧化钠、磷酸、考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、95%乙醇 3.主要仪器设备 离心机、磁力搅拌器、刀片、电子天平、紫外可见分光光度计、冰箱、pH计。 实验步骤 木瓜蛋白酶的提取 用薄不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜过时的纵线将果皮割破，深度为2~3nm，根据果实大小的不同，每个果实可以切5~10条刀口。 将木瓜放于一个大烧杯中，适度挤压木瓜，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 将手机的乳液按1:1量加入蒸馏水，搅拌1h，用NaOH将pH调至9.0。 将乳液用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 收集上清液至另一洁净的烧杯中，得木瓜蛋白酶粗酶液，测量其体积，冰箱中保存备用。 蛋白质浓度的测定 配置试剂 考马斯亮蓝实际的配置 考马斯亮蓝G250（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（质量百分浓度为85%），然后加蒸馏水定容到1L。 标准蛋白夜的配置 牛血清白蛋白（0.1mg/mL）：准确称取牛血清白蛋白0.02g，用蒸馏水溶解并稀释到200mL. 绘制标准曲线 取7支洁净干燥的试管，按表9-1进行编号，并加入各种试剂。将其混匀，室温静置5min。以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度（OD595）。 表9-1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度—标准曲线制作 管号 1（空白） 2 3 4 5 6 7 标准蛋白液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 考马斯亮蓝染液/mL 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质浓度/（μg/mL） 0 10 20 30 40 60 80 OD595 样品液的测定 将（一）中步骤（5）所得木瓜蛋白酶粗酶液进行适当的稀释（样品蛋白质含量以在10~100μg为宜），取1.0mL，加入试管中，再加入4mL考马斯亮蓝G250，立即摇匀，室温静置5min，然后用分光光度计测595nm波长处吸光值（OD595）。 实验讨论与注意事项 木瓜蛋白酶广泛存在于番木瓜茎叶和果实中，以未成熟过时的乳汁中为最高。因此，选取的材料应是未成熟的木瓜。 木瓜蛋白酶易受热失活或化学药品引起失活，所以在制备过程中要求低温、短时、卫生、忌碱、忌强酸作用。勿与铁、铜等接触。 （3）木瓜蛋白酶是一种水解酶，对人体皮肤有刺激分解作用，所以在制备时请做好相应的保护工作。 （4）样品蛋白质含量以10~100μg为宜。一些阳离子如K+、Na+、Mg+以及乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。 实验结果记录与数据处理 （1）记录不同浓度标准蛋白质溶液对应的吸光值（OD595），记入表9-1中。 （2）根据表9-1，以吸光度（OD595）为纵坐标，各标准液浓度（μg/mL）为横坐标作图，得标准曲线。 （3）记录木瓜蛋白酶粗酶液采用考马斯亮蓝法测定浓度的OD595值，查标准曲线求出蛋白质浓度。