三七皂苷促进造血祖细胞增殖及秀导糖皮质激素受体核转录因子的研究.pdfVIP

三七皂苷促进造血祖细胞增殖及诱导糖皮质激素受体 核转录因子的研究★ 高瑞兰1 陈小红1 林筱洁1 钱煦岱1徐卫红1吴超群2 1浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所(310006)2．复旦大学生命科学院 国家自然科学基金资助项目(No CFU瑚【)增殖的类糖皮质激素(GC)样效应，借鉴GC作用的信号传递途径，探讨PNS对糖皮质激 素受体核转录因子(GR_NTF)的诱导作用。方法：入骨髓造血祖细胞半固体集落培养，以不同浓 度的PNS作刺激增殖试验。选择恰当浓度的PNS(20mg／L)较长时间地诱导人粒系甩-60、红系 核苷酸探针作电泳带移动阻滞试验(翻SA)．结果：①PNS促进人骨髓红系、粒系和巨核系造 低，经PNS处理后也出现特异性条带。结论：PNS促进造血细胞增殖的效应涉及到GR-NTF，通 过诱导GR-NTF量增加，且与基因上游调控区域的启动子／增强子结合的活性增高，而调控造血 细胞增殖相关基因的转录和表达，具有类糖皮质激素样效应。 关键词三七皂苷造血祖细胞糖皮质激素受体转录因子 据报道糖皮质激素(GC)能够增加红系祖细胞集落形成，恢复再生障碍性贫血患者的造血功 甜h幻，糖皮质激素受体核转录因子(GR-NTF)具有重要的转录调控功能，与配体GC结合后， 构型发生变化，由胞浆转位至胞核，GR—NTF与靶基因上游调控区域的启动子／增强子结合，从 而启动相关基因的转录和表达。中药三七的主要有效成份为三七总皂苷(PNs)，我们已报道免疫 介导型再生障碍性贫血小鼠在骨髓抑制及造血功能低下时，PNS能够促进鼠骨髓粒系、红系造 血祖细胞增殖，改善骨髓的造血功能哺1；而且还能刺激人骨髓CD34造血干／祖细胞增殖和诱导 定向分化H1，均提示PNS具有促进造血的类糖皮质激素样效应。本文观察PNS对人骨髓粒系、 探讨PNS促进造血的作用机理，为临床应用提供依据。 材料与方法 l 40 ll 系含10 PHA—L叫(自制)和lO一‰2一巯基乙醇。上述体系混匀后，接种至24孔培养板，作三个复孔， 个细胞，CFU—E集落≥8个细胞。 2 CFU-MK集落培养及巨核细胞鉴定8份入骨髓标本接种至培养体系，含30％马血清、 20p 数集落，CFU-MK集落≥4个细胞。人巨核细胞用免疫组化SAP法鉴定，培养后细胞固定制片， 加生物素一鼠抗人CD41抗体孵育30一-50min，再加碱性磷酸酶—链霉卵白素抗体反应，然后用坚 固红显色和苏木素复染，显微镜下观察巨核细胞呈红色的阳性反应。 3药物处理人骨髓细胞和细胞株三七总皂苷(陕西正康医药有限公司)含三七总皂苷 系列的细胞株作靶细胞，常规培养在含lO％dx牛血清的IMDM培养基中。实验组选择恰当浓度的 PNS 20mg／L孵育细胞，阴性对照不加PNS，阳性对照加地塞米松注射液(Dex10～，江苏涟水 50 制药公司)。经药物诱导14d后作饥饿处理，实验组再加PNSmg／L，阴性对照不加药，阳性 对照加10qMDex，细胞与药物作用2h后提取核蛋白。 4细胞核蛋白提取收集细胞用冷PBS洗涤后，悬浮在含蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，加 10％NP-40经振荡后破碎细胞膜，离心收集细胞核，再将其悬浮在含蛋白酶抑制剂的缓冲液C Rad公司)测核蛋白浓度后分装，--70℃保存备用。重复诱导细胞和提取核蛋白三遍以上。 5 Western免疫印迹分析按本室已报道的方法哺1，将lOPg核蛋白加入SDS凝胶加样缓冲液 20pl，煮沸后用7．5％聚丙烯酰胺凝胶进行分离。将已分离的蛋白条带电转移到PVDF膜上。用含 Santa Cruz公司)。室温作抗原一抗体结合反应1．5h，TBS-T缓冲液洗涤，加辣根过氧化物酶标 记山羊抗兔的IgG二抗反应后，充分洗涤，用ECL发光剂(SantaCruz公司)作用Imin，X光胶片 曝光，作图像扫描特异性条带的密度分析。取不同批次的核蛋白，重复相同实验三遍以上。 应液中(含HEPES、NaCI、EDTA、甘油、BSA和2．5弘g／ml ATP 15min。DNA探针具有与GR-NTF蛋白结合位点的双链寡核苷酸(SantaCruz公司)，用a_U