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第九章 核酸的生物合成 DNA的生物合成 RNA的生物合成 基因工程及分子 生物学技术简介（自学） 第一节 DNA的生物合成 一、DNA的半保留复制 (一) 定义和实验证据：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制。 DNA的半保留复制的生物学意义： DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。 DNA在代谢上的稳定性并非指DNA是一种惰性物质:在细胞内外各种物化因子均可导致DNA损伤，需要修复；在复制和转录过程中DNA会发生损耗，必须进行更新；在发育和进化过程中DNA可能进行修饰、删除、扩增和重排；在进化的角度上，DNA更是处在不断的变异和发展中。 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶Ⅱ DNA聚合酶Ⅲ 亚基数目 1（单体酶） 多亚基酶 多亚基酶 5′→3 ′聚合活性 + 中 + 很低 + 很高 3 ′ →5 ′外切活性 + + + 5 ′ →3 ′外切活性 + — — DNA聚合酶Ⅲ 是原核生物DNA复制的主要聚合酶，该酶由10种亚基组成，其中?、?、?形成全酶的核心酶。具有5? ?3? DNA聚合酶活性（ ?亚基，速率高）； 具有3? ? 5?外切酶（?亚基）的校对功能，提高DNA复制的保真性（聚合酶对底物的专一性、 3? ? 5?外切酶的校对功能）。 ?亚基象夹子一样夹住DNA,使聚合酶在完成复制前不会脱离DNA分子。 拓扑异构酶?：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。 拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。 二者共同控制DNA的拓扑结构。 3、解螺旋酶 （解链酶）：通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。 6、 DNA连接酶 DNA中一条链有切口，切口一端是3′-OH，另一端是5′-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，使切口连接。不能将两条游离的DNA单链连接起来。 连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5‘-DNA 酶 + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-OH + AMP-P-5’-DNA DNA-3’-O-P-5’-DNA+AMP DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用 1、冈崎片段的发现（1968）： 同位素实验，3HdT? 短时间内为DNA小片段?一段时间后?检测到 DNA大片段。当用DNA连接酶的变异株时，检测到大量DNA片段的积累—— 证明DNA复制中有小片段合成。 由于U替代dT，被尿嘧啶-DNA-糖苷酶切除。测定DNA小片段，远远大于合成DNA的一半。 在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突变植株中，检测到一半3H标记出现在小片段（冈崎片段）中。 (五)?E.coli.染色体DNA复制过程 大肠杆菌复制的起点由245个bp构成，其序列 很保守，有两组短的重复： 3个13 bp的序列和4个9 bp的序列 前导链只需要一个RNA引物，随后链的每一个冈崎片段都需要一个RNA引物。 链的延长反应由DNA pol.Ⅲ催化。 复制体：在DNA合成的生长点（既复制叉上）分布着许多与复制有关的酶和辅助因子，它们在DNA的模板链形成离散的复合物，彼此配合进行高度精确的复制。 3、DNA合成的终止 ?? E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白—— tus 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 共6个终止位点。 原核细胞DNA的半不连续复制复制过程 在真核细胞内有五种DNA聚合酶 （与细菌DNA聚合酶的性质基本相同：底物、模板、引物、方向） α β γ