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热应激条件下内毒素对肉鸡肾脏损伤的研究 郝世秋，刘成荫，黄淑成，杨菲，陈海宁，仝宗喜+ (河南农业大学牧医工程学院，河南郑州，450002) 摘要：为了探讨肉鸡热应激条件下内毒素对肾脏的损伤作用，我们复制肉鸡热应激模型。应用鲎试剂法和分子生物学 等方法检测不同热应激持续时间血清中内毒素、肌酐、尿素氮含量变化，以及肾脏TLR4mRNA表达的影响。试验结 mRNA在肾脏中的 果显示，与对照组相比，热应激组肉鸡血清中内毒素、肌酐和尿素氮含量均是极显著升高，TLR4 表达显著上调，且随着热应激持续时间的延长差异越显著。这表明热应激刺激能使肉鸡血清中内毒素含量升高并对肉 鸡肾脏造成损伤，并且损伤程度与热应激持续时间呈正相关。 关键词：热应激；内毒素；肌酐；尿素氮；TLR4；。肾损伤 内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁结构成分，也是其主要的致病因子，细菌裂解或死亡时释放出来。 适量的内毒素可激活机体的免疫系统，有利于清除机体的病原菌和毒素，是机体的防御性反应。过量 的内毒素则可引起机体严重的病理生理反应[1，2]。热应激是指环境温度超过机体等热区中的舒适区上 限温度所致的非特异性反应的总和。当环境温度超28℃时就会出现热应激。热应激时由于肉鸡体温 导分子，在内毒素信号通路中起枢纽的作用，是将内毒素胞外信号传入胞内的唯一受体，’在介导内毒 素各种病理生理效应中发挥着重要作用。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1试验动物 健康的20日龄AA肉鸡50只，购于开封正大肉鸡繁育基地。 1．1．2试验试剂 细菌内毒素标准品、血液内毒素检测用1号液体处理剂、2号液体处理剂、细菌内毒素检查用水 试剂盒：美国Promega公司生产；爱德士生化分析专用试纸板。 1．13试验器材 姜堰市新康医疗器械有限公司生产：无热原玻璃试管、无热原玻璃空安瓿：广东湛江博康海洋生物有 EpRealplex型 TEST8008。 荧光定量PCR仪：Eppendorf，Germany公司生产；爱德士生化分析仪VET 1．2方法 1．2．1试验分组 按照李守军和李玉保等【4，5】肉鸡热应激病例模型复制方法，将肉鸡分成对照组(20只)和热应激 组(30只)在常规环境中适应性饲养2周后进行热应激处理。 1．2．2样品采集与处理 试验开始后将热应激组环境温度在20 续2、5、10h时分别对热应激组和对照组肉鸡进行心脏采血各5ml，取0．5ml移至含有1号处理液 的离心管中用于检测血清中内毒素含量；另一部分血液进行抗凝处理，经离心用于血清中肌酐，尿素 氮含量的测定。采血后将所有受试鸡剖杀，取肾组织于液氮中保存待测。 1．3引物设计 Premier 5．0软件设计两对引物。 根据已经发表【6]的鸡的TLR4基因的mRNA序列运用Primer TLR4引物序列：上游引物：5GAGAACCTCAATGCGAT’GC3’，下游引物：5ATAG AA GAACCTCTGACAACG3’；GAPDH引物序列：上游引物：5’TGA 362 Green 级别)。使用SYBRI对RT—PCR产物进行非特异性标记。 1．4数据处理 试验数据采用SPSSl ANOVA的方法进行方差分析。另外，TLR4mRNA在 6．0软件的One．Way 肾脏中的相对表达采用RT—PCR的zxzxCT法进行数据处理。 2试验结果 2．1临床表现 热应激后，对照组