假丝酵母原生质体形成与再生的研究StudiesonFormationandRegenerationofProtoplastfromC.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Befling)118(2):43-451996 假丝酵母原生质体形成与再生的研究① 王 沁 厦（门大学生物系，厦门361005) 摘要 本文研究了菌龄、酶系统、脱壁促进剂、渗透压稳定剂对假丝酵母Y,：原生质体形成与再生的 影响。综合考虑形成率与再生率后，选用对数生长中期的菌体于 1%蜗牛酶、35℃下作用60分钟制备 原生质体，并于以17%蔗糖作渗透压稳定剂的再生培养基中再生效果为好． 关健词 假丝酵母，原生质体，形成与再生 StudiesonFormationandRegenerationofProtoplast from Gandidasp. WangQin (DepartmentofBiology,XiamenUniversity,Xiamen361005) 原生质体融合技术作为高频重组的有效方法和遗传学研究工具，近年来已受到国内外生物学者的极大重视。 要取得融合成功，首先需对细胞壁进行消化，形成大量的原生质体，并使原生质体能高频率地再生细胞壁。微牛 物原生质体的形成与再生受菌龄、酶解条件、渗透压稳定剂等因素的影响，囚而，要制备特定菌种的原生质体， 必须摸索该菌种原生质体形成和再生的条件．在本文中，作者对假丝酵母原生质体的形成和再生进行厂研究。 1材 料 一与 方 法 1.1菌种 假丝酵母 C（andidasp.)Y,：为本实验室保贮菌株。 1.2培养基 1.2.1YEPD液体培养基(1（) ．蛋白脉2%，酵母膏1%,葡萄糖2%,pH6.0. 1.2.2YEPD固体培养基 在YEPD液体培养基中加2％琼脂． 1.2.3高渗透压培养基 YEPDS为 YEPD加 17％蔗糖，YEPDK为加0.8moi/LKCI,YEPDMg为加 0.6mol／LM9S04,YEPDB为加 IM01／L山梨醇． 1.3试剂 1.3.1PC等 PC:0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2. PCS:PC加 17%蔗糖；PCK:PC加0.8mol/LKCI; PCMg:PC加0.6mol／LMgS04;PCB:PC加LOmo1／L山梨醇． 1.3.21％蜗牛酶 用PCB液配制 经（。.22um微孔滤膜过滤）． 1.4实验方法 1.4.1原生质体的制备 将50ml活化的Yon：菌株接种于250mlYEPD三角瓶中，30℃摇床培养16小时，取 2.5m1培养液，3000rpm离心5分钟，PC液洗两次，加人2.5ml1蜗牛酶，30℃水浴振荡处理50-90分钟， ①福建省自然科学基金资助项目。 44 遗 传 HEREDITAS(Beijing)1996 18卷 取样镜检．当90％以上细胞转变为原生质体后，终止酶处理 即（停止30℃水浴振荡），离心．PCB液洗两次，即 得原生质体． 1.4.2原生质体形成率与再生率的测定 采用平皿菌落计数方法，形成率%（)=A-B/Ax100，再生率 （％） =C-B/A-Bx100．式中，A：蜗牛酶处理前的活菌数，B:蜗牛酶处理后未脱壁的活菌数，C:蜗牛酶处理后 未脱壁的菌落数与原生质体菌落数之和． 2结 果 与 讨 论 2.1菌龄对原生质体形成与再生的影响 分别取对数生长早期 （12小时）、中期 （16小时）和稳定期 2（2小时）的菌体制备原生质体 表（1).可 见，形成率随菌龄的增大而下降，再生率则增加． 表1菌龄对原生质体形成与再生的影响 一：一}一}(J}}t)一仁一T-,1a*%() 仁一二生一%() 12 ｛ 97.8 一 30.1 16 1 95.4 一 40.1 ＿ 22二 ｛二“．曰90.1 ｛ 习全 一般而言，原生质体的产量随菌龄不同而有别，在对数生长期为最高