口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建.pdfVIP

动物医学进展 ，2004，25(4)：104—106 ProgressinVeterinaryM edicine 口蹄疫多基因杆状病毒转移载体的构建 云 涛h，冷青文h，郭慧琛 ，刘在新h，张居农 ，谢庆阁 (1．中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验室 ，甘肃兰州 730046， 2．石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003) 中圈分类号 ：$856 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2004)04—0104-03 摘 要：采用分步 PCR扩增连接的方法将 口蹄 单位疫苗的前提。研究表 明，结构蛋 白前体 P1需要在 疫病毒结构蛋 白基 因P1，非结构蛋 白基 因2A、 2A蛋 白酶和3C蛋 白酶 的参与下方可进一步裂解为 2B、3C蛋 白酶和3D聚合 酶按正确 的读码框依 次 VPO、VP3和 VP1结构蛋 白，从而刺激 动物产生保护性 连接克 隆入 pGEM—T栽体 。然后 ，将切取 的 目的 的中和抗体Ⅱ-3]。另据 FMDV非结构蛋白2B在 自然宿 主中是细胞免疫、体液免疫 的潜在刺激因子 [4-s]及3D聚 基 因亚克隆入杆状病毒转移载体 pMelBacB。构 合酶是一种重要的T细胞抗原[5试验依据。本实验构 建成功 的重组 pMelBacB／P12X3C3D转移栽体 建了包含FMDVP1、2A、3C、3D及部分2B编码区的多 经测序鉴定，含有完整的 目的基 因袁达盒，转移 基 因杆状病毒转移载体 ，为 FMDV 的基 因工程亚单位 载体可与杆状病毒骨架载体进行昆虫sf9细胞 内 疫苗的研制奠定基础。 同源重组 ，以产生重组杆状病毒 。 1 材料与方法 关键词：口蹄疫病毒；杆状病毒；转移栽体 1．1 主要材料 口蹄疫 (foot—and—mouthdisease，FMD)是偶蹄动 pGEM ／P12X3C和 pGEM ／3CD 阳性质粒 由本所 物易感的一种烈性、急性传染病，该病发展迅速 ，危害很 病毒室构建保存 ；pMelBacB穿梭载体购 自Invitrogen 大，给世界各国的畜牧业造成了巨大的经济损失 。目前 ， 公司；pGEM—TEasy载体购 自Promega公司；DH5a宿 大多数国家对该病的主要防制措施是采用传统疫苗接 主菌为本实验室保存。高宝真 Taq酶及 限制性内切酶 种，但其具有热不稳定性、免疫期短，生产成本高等缺 均购 自大连宝生物工程有限公司 (TaKaRa)。 点。近年来免疫 国家的 口蹄疫频频暴发流行，使人们开 1．2 引物 的设计和合成 始对传统疫苗的安全性有所怀疑。因此，开发安全有效 根据 FMDV标准毒株 O1K株 的序列[a]，用 Oligo 的口蹄疫新型疫苗成为防治该病亟待解决的问题。 5．O软件设计2对引物 ，引物均由大连宝生物工程有限公 在多种新型疫苗 中，基因工程亚单位疫苗的化学本 司合成。预期的2个 目的片段长度分别约为3000bp和 质及免疫特点提供 了最具潜力的选择 ，而构建 口蹄疫病 1400bp。引物序列及位置见表1。 毒抗原的真核表达转移载体是研制 口蹄疫基因工程亚 裹1 引物的序列与位置 Table1 Sequenceandpositionofprimers 注：下划线标 出的为酶切位点． 1．3 片段 I(3000bp)的获得 10rain。PCR产物用10g／L琼脂糖凝胶 电泳鉴定。 以A1和 A2为一对 引物 ，pGEM ／P12X3C质粒上 1．5 目的片段 (4400bp)的获得 的P12X3C基 因为模板 ，扩增 P12X3C片段。PCR条 以片段 I片段 I为模板，用引物 A1和B2将2条片段 件：94℃ 5rain；94℃ 1rain2OS，6O℃ 50S，72℃ 通过PCR扩增连接成全长的 目的片段P12X3