固定化胰蛋白酶活力的测定方法探讨.pdfVIP

维普资讯 氨基酸和生物资源 2007，29(2)：33～35 Am／noAcids BioticResources 固定化胰蛋 白酶活力的测定方法探讨 库汉生，姚晓玲 ，张 婷，刘丹松 (湖北工业大学生物工程学院湖北 武汉430068) 摘要：对 自制的固定化胰蛋白酶(ImmobilizationTrypsin，ITP)分别经过冷冻干燥 、真空干燥后定量测定其酶活力 ，与由湿 态直接定量法(DQA)测定的活力进行 比较。试验表明，直接定 法测定的酶活力比前两者高，而且操作简单。 关键词：固定化 ；胰蛋白酶；活力回收率 中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：1006—8376(2007)02—0033—03 近年来，胰蛋 白酶广泛应用于食品、医药、化工 有限公司；YOD一230冷冻干燥 ：11}le珊oSavant 行业。如食品工业中用于生产活性多肽CPPs、酒类 和饮料的澄清；临床上用于抗炎症和消化药物的复 2 方法 配；工业生产上用于皮革加工和生丝处理等，显示了 2．1 固定化胰蛋 白酶的制备 其广阔的应用前景 J。但 由于液相的胰蛋 白酶 自 称取0．2g壳聚糖，置于50mL烧杯中，加人体 身降解作用，使酶促反应难以控制，催化效率下降， 积分数3％冰醋酸溶液20mL，在 50℃水浴中搅拌 不利于产物的提纯精制，以致成本提高。而固定化 溶解，在高速磁力搅拌下，加入2mol·L NaOH至 酶技术的应用能够很好地解决以上问题，它可以增 壳聚糖产生 白色沉淀 (pH8．0～pH8．5)，搅拌 10 强酶的稳定性、提高酶的催化效率，并易于产物的分 min后立即加入体积分数4％戊二醛8mL，在．30℃ 离。 下磁力搅拌 10h后，静置0．5h，抽滤，用蒸馏水洗 近20年来，国内外对固定化胰蛋白酶的制备工 至中性，将处理后的壳聚糖加入 2g·L 胰蛋 白酶 艺作了大量研究，但是固定化胰蛋 白酶活力的测定 缓冲液 12mL，磁力搅拌30min后，于4~C冰箱中固 仍是研究的难点，尤其是固定化胰蛋 白酶的定量是 定化 12h，抽滤，用磷酸缓冲液洗掉未固定化的酶， 关键，原因是固定化酶制备成功后，水份含量 比较 即制得固定化胰蛋白酶。 高，不易于定量。本试验对 自制的固定化胰蛋 白酶 2．2 酶活力单位的定义 分别经过冷冻干燥、真空干燥后定量测定其酶活力， 在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增 并与由湿态直接定量法测定的酶活力进行比较，优 值与 1mol·L 酪氨酸在275nm处吸光度相当时 化酶活力的测定方法。 的酶量为一个胰蛋 白酶活力单位。 2．3 游离胰蛋白酶活力的测定 1 试验材料与仪器 游离酶活力测定方法 J：精确称取 10mg胰蛋 壳聚糖(脱乙酰度I90．0％ ，粘度 100cps)上 白酶，用2mol·L～，pH6．1的CoC1溶液稀释至50 海伯奥生物科技有限公司；胰蛋白酶 (1：250)：Am． mL，再取该溶液2mL用冰冷的pH7．5±0．1的硼砂 resco分装 ；戊二醛 (25％)：国药集 团化学试剂有限 一 硼酸，氯化钠缓冲液稀释至250mL。取 3支试 公司；酪蛋白：北京奥博星生物技术责任有限公司；