一株产凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用.pdfVIP

一株产凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选、鉴定及应用 刘河涛，李洋，李红玉﹡ 干旱与草地生态教育部重点实验室，兰州大学生命科学学院，兰州（730000 ） E-mail ：lihy@ 摘 要：从十年奶酪中分离筛选到一株能产凝乳酶的细菌 QL-2。通过菌体形态观察、环境 因素影响的测定、生理生化特征以及16S rDNA 寡核苷酸序列分析，鉴定该菌为枯草芽孢杆 菌，保藏在CCTCC ，保藏名Bacillus subtilis QL-2 ，保藏号M208023 。经发酵培养，该菌能 产凝乳酶，其发酵液具有凝乳功能，活性达到62.83SU。Ca2 ＋能明显促进凝乳活性；底物pH 值为5.8 时发酵液的凝乳速度最快；发酵液凝乳的最适反应温度为60℃。 关键词：凝乳酶，枯草芽孢杆菌，筛选 1. 引言 干酪富含多种营养成分，容易消化吸收，又不易致肥，因此被营养学家奉为理想的食品, [1] [2] 誉之为“奶黄金” 。凝乳酶是干酪生产中凝固牛乳的关键性酶制剂 ,它是一种酸性蛋白酶。 凝乳过程可分为两步：第一步是酶专一性地水解乳中к-酪蛋白多肽链的105～106 位苯丙氨 酸和甲硫氨酸之间的肽键，形成稳定的副 к-酪蛋白及亲水性的糖巨肽；第二步是当总的 к- 酪蛋白被水解掉约85 ％时，在Ca2＋存在下通过在酪蛋白胶粒间形成的化学键形成凝块或凝 [3,4] 固的乳，从而使变化的凝乳酶、酪蛋白胶粒发生沉淀 。 凝乳酶来源广泛，可从动物、植物及微生物中得到。传统的凝乳酶来源于小牛皱胃（第 [5]，但随着世界奶酪产业不断发展壮大，每年宰杀大量小牛以获得凝 4 胃）中提取的皱胃酶 乳酶的方法显然是与现代工业发展极不协调的；植物性凝乳酶可从木瓜、菠萝、无花果属植 物、红花等植物中提取[6],但其蛋白水解能力强，并且受时间、地域、生长周期长等条件限制， 难以发展；目前发现有40 余种微生物可生产一定活力的凝乳酶，这些微生物主要是放线菌、 细菌和真菌等[7] 。自1964 年，Arima[8]发现毛霉属微小毛霉(Mucor pusillus)可以产生高活力 凝乳酶后，许多科学家对其展开了大量研究。中科院微生物所的钱世均等人[9]从 19 株毛霉 中筛选出一株微小毛霉菌株，完成了菌种培养、酶提取和纯化，发现经纯化后，纯酶的凝乳 活力与蛋白水解活力的比值大大提高，且完全没有纤维素活性。并对其产生的凝乳性蛋白酶 进行了纯化和酶学性质的研究。郭光远等人[10]在对云南不同地区放线菌区及资源的考察过 程中，对所分离到的2502 株放线菌、真菌、细菌进行了凝乳酶产生菌的筛选，结果发现放 线菌中链霉菌属（Streptomyces ）、小单胞菌属（Micromonospora ）、马杜拉放线菌属 （Actinomadura ）等和9.8 ％的真菌及8.8 ％细菌中都有一定的产酶活力。目前在国际上的微 [11] 生物凝乳酶主要是由米黑毛霉生产的 。 本文分离到一株枯草芽孢杆菌，能产生凝乳酶，其发酵液具有凝乳活力，通过对这株枯 草芽孢杆菌和对该菌产生的凝乳酶的系统研究。发现该菌生长周期短，受气候、地域、时间 限制小；用其生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高，具有较大的开发潜力。枯草 芽孢杆菌是常见的污染菌，并不是致病菌，利用其发酵所产的凝乳酶适合工业化生产干酪。 2. 材料与方法 2.1 材料 - 1 - 2.1.1 样品 菌株分离样品来源于保存十年的奶酪。 2.1.2 培养基 酪蛋白水解平板：取5g 脱脂奶粉加入50mL 蒸馏水中或用50mL 脱脂牛奶，另称 1.5g 琼脂溶于50mL 蒸馏水中，将两液分开灭菌。待冷至45～50℃时，将两液混匀倒平板即成。 NA 液体培养基：牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母浸膏1g、蒸馏水1000ml、 pH7.0 。 NA 固体培养基：牛