一株异养硝化细菌的分离及系统发育分析.pdfVIP

# 期 张光亚等：一株异养硝化细菌的分离及系统发育分析 %)A !# 碳源和氮源试验 碳源试验时，培养基氮源改为硫酸铵（ ），碳源分别为浓度 的乙酸钠、甲酸 ! # $ ! # $ 钠、苹果酸，葡萄糖、衣康酸、乙酰胺、酵母膏和蛋白胨。氮源试验时，碳源改为乙酸钠，所 用氮源分别为浓度! # $ 的乙酰胺、硫酸铵、硝酸钠、亚硝酸钠、尿素和氨基乙酸。接种 （接种量 ，下同）培养 后，测定菌体数量和亚硝酸量。重复 次。 %$ !’ ( !$ 氨化和硝化作用试验 菌株活化后接种于液体培养基中，以乙酰胺为碳源和氮源检测了该分离物的生长量 和硝化作用强度。重复( 次。 !% 分离菌株反硝化活性 硝酸钠（浓度为! # $ ）为唯一的氮源，培养基煮沸)*+, 后取#!*- 放入%#!*- 的血清 瓶中，菌株活化后接种于该培养基中，隔数小时测定菌体生长量和亚硝酸量。重复 次。 ( ! 异养型亚硝化细菌的形态及系统发育分析 ! ! 显微摄影：用带拍摄装置的./0*123 456# 型光学显微镜相差拍摄。菌落中的菌体 用接种针挑取后涂抹在载玻片上，滴加 滴蒸馏水，加盖盖玻片，进行显微摄影。 %78 ! # %9 :;= 的?@ 扩增和测序：从平板中直接挑取一环菌体，加入至 %!! - 重蒸水 ! 中，旋涡混匀后，沸水浴 ， 离心 ，上清液直接用于 扩增模板。用 A*+, %# !!!:7*+, )*+, ?@ 于 反应的引物为一对通用引物（ ： ）。 %9 :;= ?@ ’BB1 77 3+/C D 2+E D FE D GH71:+*H:7 IFBFGF3H D ’B*/ 正向引物 ： ；反向引物 ： 49JK7#! )L6=M=MNNNM=N??NMM?N?=M6(L 49@%)8%7#! )L6==MM=MMN6 M=N??=M??M?=6(L。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。?@ 反应体系 （ ）为： 缓冲液 ， （ ） ， ，引物 和引物 )! - %! O ?@ ) - PQ?/# #)**R/7 - 8 - IN # - 49JK7#! ! ! ! ! 各 ，模板 ， 酶 （ ） ，重蒸水 。 程 49@%)8%7#! % - ;= % - NFS %! !!!T7*- ! ) - () ) - ?@ ! ! ! ! 序如下： ； ， ， ； 第 步循环 次； % U8 V #*+, # U8 V %*+, )V %*+, A#V #*+, ( #