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全基因组甲基化研究技术小结 DNA 甲基化是基因组DNA 的一种主要表观遗传修饰形式。近年来，大量研究表明DNA 甲基化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生，起 着至关重要的作用。甲基化研究成为表观遗传学的热点，相应的技术也是层出不穷，根据实 验目的的不同，这些技术大体能够分成两类：全基因组(高通量)甲基化研究技术以及特异性 甲基化位点(低通量)研究技术。下面将介绍几种当前最常用的一些技术全基因组或者说中高 通量甲基化研究手段，供大家参考： 芯片平台： 基于芯片平台的全基因组甲基化分析无疑是性价比最高的甲基化图谱分析方式，目前 市场上主流的实验平台主要是illumina 和agilent，相应的产品包括illumina 人的商品化芯片 (HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip, HumanMethylation450 DNA analysis BeadChip)，agilent 人和小鼠的商品化芯片(Human CpG Island Microarray，Human DNA Methylation Microarray 以及Mouse CpG Island Microarray)，过去Roche NimbleGen 也有 相应的产品，但从今年下半年已经停产。 使用不同的实验平台，操作方法也不同，illumia 芯片前期处理采用的是亚硫酸盐处理， 将甲基化的差异转变成碱基上的差异，然后利用两个位点特异的探针检测这些化学上差异的 位点，一个探针是为甲基化位点(M 磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U 磁珠 类型)设计的，结合后通过单碱基延伸掺入一个标记了的ddNTP，通过计算甲基化位点和未 甲基化位点掺入的荧光信号强度检测DNA 甲基化程度。该项技术被称为Infinium 技术，即 单碱基延伸技术，包括InfiniumI 和InfiniumII，示意图如下： illunina 最经典的产品莫过于HumanMethylation27 DNA analysis BeadChip，该芯片 含有27，578 个CpG 位点，产品性能和评价都很高。不过，随着研究逐步的深入，这款 产品已经不能满足研究的需要，慢慢被另一款产品HumanMethylation450 DNA analysis BeadChip 取代，包含450,000 个CpG 位点，该产品最大的特点在于覆盖范围广，而且除 了CpG 岛，还涵盖有CpG shores 和CpG shlves 区域，以及non-CpG 位点以及miRNA 启动子区域等，无疑是DNA 全基因组甲基化研究的又一利器，在对基因组non-CpG 位点 研究[1]以及在Avon Longitudinal Study of Children and Parents (ALSPAC) [2]中都用到这 款芯片。而goleden gate 是illumina 的定制芯片平台，适合于样本量大，中高通量的甲基 化研究。芯片以矩阵微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM))的格式，每个panel 可以检测96 个样本，根据客户的定制要求，每个样品可同时检测384-1536 个甲基化位点。 而安捷伦采用的是免疫共沉淀的方法(MeDIP-chip)的方法。基因组DNA 分成两份，一 份用来做MeDIP，加入抗5- 甲基化胞嘧啶核苷抗体,使用免疫磁珠法分离样品中甲基化DNA 片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA 片段被洗脱;另一份作为对照。两个样品都 标记荧光(富集的样品input 用Cy5 标记，对照用Cy3 标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个 探针的Cy5/Cy3 强度比例显示出该区域的甲基化程度。 agilent Human CpG Island Microarray 规格为1x244K，包含约195000 个探针检测 27800 个CpG 岛。Human DNA Methylation Microarray 规格为1x244K，能够检测27627 个扩展了的CpG 岛(expanded CpG islands)和5081 个甲基化不做的区域(UMR region), Mouse CpG Island Microarray 规格为2x105K，能够检测16030 个CpG 位点。agilent 还 有著名的earray 平台，能够根据客户要求对芯片进行定制。欧易生物和合作伙伴利用该平 台定制了一款专门针对肿瘤相关的芯片，绝大多数基因是针对基因启动子区域的CpG