荧光定量PCR全攻略.pdf

实时荧光定量PCR （qPCR ） 实时荧光定量PCR （qPCR ） 提纲 • 实时荧光定量PCR （qPCR ）原理 • 实时荧光定量PCR （qPCR ）实验设计 PCR反应 荧光物质 Mg2+ Taq DNA多聚酶 或 2+ Mn 模板DNA dCTP dGTP dUTP 引物 dATP 缓冲液 SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I 荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不 断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，经过一定 的循环后，得到一条荧光扩增曲线图 定量原理 Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光 信号）到达阈值时所经过的扩增循环数 C(t) 值 C(t) 值 18.12 +/ - 0.04 阈值线 96孔Ct值的一致性 定量原理 • 理想的PCR反应： n (1) • X=X * ２ 0 • 非理想的PCR反应： • X=X (1+Ex)n (2) 0 • n：扩增反应的循环次数 • X：第n次循环后的产物量 • X0：初始模板量 • Ex：扩增效率 定量原理 PCR反应进入指数扩增期: XCt= X0 (1+Ex)Ct =N (1) X :荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. Ct 方程式(1)两边同时取对数得: logN =logX (1+Ex)Ct (2) 0 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex)*Ct+ logN (3) 浓度的对数与循环数呈线性关系，根据样品扩增 达到域值的循环数计算出样品中所含的模板量 荧光化学 • 扩增序列不特异结合 SybrGreenI • 扩增序列特异结合