SDS_PAGE法测定His_tag融合蛋白分子量产生偏差的原因.pdfVIP

64 植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica 　2000 , 26( 1) :64～68 SDSPA GE 法测定 Histag 融合蛋白分子量产生偏差的原因 唐威华 　张景六 　王宗阳　洪孟民 ( 中国科学院上海植物生理研究所 ,上海 200032) 摘要 : Histag/ NiNTA 系统是新发展起来的一个亲和 电荷的粒子 ,经电泳 , 由于聚丙烯酰胺凝胶的分子 纯化重组蛋白的有用工具 ,现常用于基因编码产物的 筛效应 ,不同大小的蛋白质分子向阳极移动有快慢 特性研究中。SDSPAGE 是实验室测定蛋白质分子量 的区别 ,因此可以由电泳后各蛋白的泳动距离推算 通常采用的方法 ,而许多实验室用此方法检测 Histag ( ) 其分子量 Sambrook 等 1989 。由于 SDSPA GE 法 融合蛋白时却常发现测得的分子量偏大 ,产生偏差的 测定蛋白质分子量已是一种很成熟的实验手段 ,许 原因尚未阐明。为弄清这一问题 ,本实验室在研究一 多实验室也将此方法用于 Histag 融合蛋白分子量 个 Histag 融合蛋白P73His 时 ,首先用 SDSPAGE 法测 得其分子量确实比理论计算值大 ,然后对其进行 C 末 的检测 , 以初步判断表达的纯化产物是否预期的蛋 端氨基酸顺序测定 、电喷雾质谱分析 ,结果证实其实际 白。但是不少研究者发现 Histag 融合蛋白在 SDS 分子量与理论值一致 。酶切去除包括 Histag 在 内的 PA GE 中表现 出的分子量大于其应有 的分子量 部分肽段使 SDSPAGE 法测量蛋白分子量的偏差大大 (Harwood 1994) ,一些研究者在文献中提到了这一 降低 ,证实 Histag 确实是造成偏差的原因之一 。推测 ( ) 现象 Niu 和 Guiltinan 1994 ,另一些研究者则回避 由于 Histag 中的碱性氨基酸的作用造成蛋 白在 SDS ( 了这一问题 Kim 和 Chung 1997 , DeMaria 和 Brewer PAGE 中迁移变慢 ,而导致偏差 。这一现象值得引起 1996) ,但他们对蛋白确切分子量都未作进一步测 有关研究者的注意 。 定 ,对造成偏差的原因也未进一步研究 。 本实验室计划采用 Histag/ NiNTA 系统对一 关键词 : Histag/ NiNTA ,融合蛋 白, SDSPAGE , 电喷雾 系列新克隆到的水稻基因进行表达及产物纯化 ,因 质谱 ,分子量 此试图首先搞清这一偏差的产生原因。本文报告 学科分类号 : Q74 在将所研究的一个水稻 cDNA 片段 c73 的 5 ’端连 　　近年来 ,在分子生物学或基因工程研究中 ,为 接上一段含有 Histag 编码顺序的核苷酸后 ,在大 了便于得到被研究基因所编码的蛋白,往往将所研 肠杆菌中表达出的融合蛋白通过与NiNTA 树脂的 究