显微制片的一般原理与方法.docVIP

第四章 显微制片的一般原理与方法 第一节 石蜡切片 显微制片是生命科学实验技术中的重要组成部分，石蜡切片是动物﹑植物和病理组织切片工作中最重要﹑最常用的一种方法，一般包括材料的固定﹑洗涤﹑脱水﹑透明﹑包埋以及切片和染色等过程，其中的每个步骤都能影响制片的效果和质量。 1. 材料的选择与分割 (1) 应选取新鲜的材料，然后立即固定处理。 (2) 材料大小要适当（直径5 mm左右） 2. 固定及保存固定：将器官、组织、细胞按原来的形态保存下来，并为后续制片保持固有形态，这样才达到固定的要求。 保存：组织块经杀生固定后，能较长时间保存下来。经久保存下来的组织块，仍能制片，但不同试剂的保存效果差异较大，如酒精、醋酸、福尔马林液保存时间较长，而铬酸类固定液，常须转换至70％酒精液后，才可较长时间保存。 需注意以下有关问题： (1) 要注意固定目的物本身的结构性质，以便选用适合的固定液，如一般根、茎、叶的组织切片用FAA，根尖、花药压片材料用卡诺固定液，另外，固定时间的长短，要根据材料的特点而增减。 (2) 固定微小材料可直接投入固定液中，而对于较大的材料，则须先将其解剖成较小的材料，并迅速投入固定液，以完成固定作用。 (3) 当体积较大的材料，出现外部已超过固定作用，而内部仍未达到固定目的时，必须考虑用透入快的固定液，如醋酸酒精或苦味酸混合液。 3. 脱水 (Dehydration) 常用的脱水剂有乙醇（酒精）、正丁醇、叔丁醇、丙酮等药剂，其目的：(1) 除去组织内的水分，并使其组织细胞变硬；(2) 脱净水的组织，才能使溶解的石蜡顺利进入细胞内，以便进行石蜡切片；(3) 脱水后的组织再经透明剂（二甲苯、氯仿等）透明，最后才能经加拿大树胶封藏，否则组织材料不透明，无法在显微镜下观察。 4. 透明 () 透明是制片过程中的基础工作，材料经各级酒精脱水以后，要经过常用的有机榕剂（氯仿、二甲苯等）进行透明，这样便于包埋浸渍石蜡及封片过程中加拿大树胶进入和溶合。只有当组织材料全为透明剂所占，并在显微镜下观察呈透明状态时，这种材料才符合制片要求，故透明是制片的重要环节，万不可忽视，凡未经透明的材料（不论在哪一步骤透明）都必须重新退回处理，直到材料透明再继续向下处理。 常用透明剂种类：二甲苯、氯仿、苯、甲苯、丁香油、冬青油、香柏油等。 透明方法：以氯仿及二甲苯为常用透明剂。氯仿透明的优点是：(1) 组织材料在氯仿中浸存，收缩不显著：(2) 易挥发，如浸蜡时，使用的氯仿经包埋前的处理便于除去。其缺点有：(1) 渗入组织内力量较二甲苯弱、时间长，(2) 氯仿能使染料褪色，故染色后的切片处理不宜用氯仿透明而用二甲苯。 5. 浸蜡 (Infiltration) 在装有材料的纯氯仿瓶，加入纯石蜡粉末。其方法是：用单面刀片刮取石蜡屑，加入量宜先少后多，般分2~3次加入，每加完一次碎蜡后，即放回至恒温箱中部，温度控制在3840℃之间。浸蜡完全的材料，组织块显得十分透明。这种以石蜡透入细胞组织内的全过程，称为浸蜡。完成浸蜡的组织块，才便于包埋、切片等工作。在浸蜡瓶放入温箱中过夜时，要注意材料不能太多，瓶塞不要盖得过紧。 6. 包埋包埋是将浸蜡完全的组织和熔解的石蜡，倒入蜡块盒，随之快速冷却定形成蜡块的过程。包埋前需做以下的准备工作： 6.1 石蜡的选取按不同的要求选用不同规格的石蜡 软材料用54~56°C熔点的石蜡，若切5 μm以下的厚度或炎热夏季切片时，宜用5860℃的石蜡。选用时还须检查石蜡细致度、无气泡、无灰尘、无透明点痕、切片时不断碎等优点。 新石蜡和用后已切碎的石蜡，都必须先熔化，然后用折叠成漏斗形的34层滤纸过滤除去渣棒。 6.2 各级石蜡配制与使用 将石蜡配成50%、75%、100%三级。50%石蜡由一半石蜡和一半二甲苯配制而成，75%石蜡系由75%石蜡与25%二甲苯配成。每级石蜡用大口器皿装且有盖覆盖，这样，便于多处理材料和包埋时操作， 6.3 常见问题 经各级石蜡处理恰当的材料，一般都沉入杯底部，如见有材料在蜡内漂浮、色白，这类材料可能由于在抽气时空气未排出，脱水不完全，透明不彻底等环节造成，需单独包埋存放，另作处理。若材料处理数量较多，应予丢弃。 (2) 各级蜡杯温度，最好不超过蜡的熔点，温度过高材料会发生收缩变脆，温度过低，透蜡及氯仿排除不彻底，也会影响制片，因此温箱外需有温度计指示温度，蜡杯放置温箱的下层位置，可达到浸蜡包埋要求。 7. 石蜡块的分割、整修与固着 先在桌上垫一层纸，然后放置一块小木板。分割下的每个小样品四周留3~5mm的蜡边进行整修，每个蜡边与材料尽量呈平行线，上窄下宽，削好的样品，以纸袋包装好。将坚实平整的台木块，放于垫纸上，再将台木上用烫蜡铲烫放一层稍厚的石蜡，以左手执石蜡小样品块，右手执烫蜡铲于酒精灯上烧热，再放置台木