BMP-7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中与作用.pdfVIP

B肝一7在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞 成骨分化过程中的作用 硕士研究生：李正 指导老师：吴文 摘要 【研究背景和目的】 骨质疏松(Osteoporosis)主要是由于骨吸收与骨形成之间的平衡被打破， 骨吸收量大于骨形成量，从而引起骨量减少的一种疾病。一般认为，破骨细胞 活性增强，导致骨吸收增加，是形成骨质疏松的重要原因。 marrowstromalstem 骨髓间充质干细胞(Bone cells，BMSCs)在特定的诱 导条件下，可以向不同的细胞方向分化，包括成骨细胞、神经细胞、心肌细胞、 软骨细胞、脂肪细胞等。鉴于BMSCs具有定向成骨分化的潜能，骨髓间充质干 细胞也成为人工骨材料的主要来源之一。BMSCs的研究也逐渐引起人们的关注。 BMSCs成骨转化过程中有多种成骨标志物，其中碱性磷酸酶(ALP)活性 的提高是成骨分化的重要标志之一，另外ALP也参与成骨细胞的结节钙化。骨 形态蛋白(Bone morphogeneticprotein，BMP)是多功能生长因子，属于转化生 长因子．p(TGF．D)超家族，是一组具有类似结构的保守的功能蛋白组成，能够 在体内诱导骨和软骨形成，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期软骨修复及 骨骼的胚胎发育和再生修复等方面起重要作用。已知的已经被克隆出的 BMPcDNA有17种，目前的研究表明能有效地促进BMSCs向成骨细胞分化， 诱导骨的形成的BMP主要是BMP2／3／4／5／7。BMP．7是骨形态发生蛋白家族中 的一员，主要在骨组织和肾组织中表达，特别在骨发育和骨折愈合过程中高表 摘要 达。研究发现BMP．7在自体骨表面可以生成关节软骨面，还可以在某些特定的 环境下修复软骨、肌腱和韧带。国内外研究表明给予外源性BMP．7可促进BMSCs 向成骨转化。国外研究表明应用BMP．7治疗骨损伤的治愈率明显高于对照组。 因此BMP．7作为促进骨形成的重要骨形成蛋白因子，引起越来越多人的关注。 属于Sp／XKLF家族，它是一个由428个氨基酸组成的蛋白质，研究表明OSX 蛋白分布于细胞核中，其作用与组织的分化成熟密切相关。在OSX基因剔除的 小鼠胚胎中，膜性骨骼的致密间充质和软骨内骨骼的骨膜及间充质中，成骨细 胞分化的各种标志物的表达水平严重降低或者缺如，可见成骨细胞的分化被完 全阻断。OSX基因剔除细胞可表达软骨细胞的特征性标志物，因此OSX可能具 有抑制骨／软骨祖细胞向软骨细胞分化的功能。 雷奈酸锶(Strontiumranelate，Sr)是新型的抗骨质疏松药物，具有促进骨 形成，抑制骨吸收的作用，它能保护去卵巢大鼠的骨流失，并且可促进成骨细 胞ALP活性的表达。给予sr治疗能明显促进成骨细胞转录因子水平的增高。此 外越来越多的研究者关注分子水平上sr促进骨形成的机制。本实验通过观察 促进骨形成的作用。通过添加BMP．7阻断剂noggin观察Sr促进骨形成过程中 胞转化过程BMP．7所起作用，为临床上应用sr防治骨质疏松等疾病提供新颖的 实验依据。 【实验方法】 1、SD大鼠骨髓间充质干细胞培养 本实验拟采用步骤相对简单的全骨髓贴壁法将BMSCs从骨髓中分离出来，并 在体外进行培养和扩增，倒置显微镜下观察其增殖和生长特性。以此建立一套 稳定有效、重复性好的BMSCs体外分离、培养和扩增的方法。并取生长良好 的第34代BMSCs用做实验。 2、分别用细胞碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、免疫印迹法(Westem H 硕士学位论文 的表达、钙结节的表达、BMP．7的表达水平及特异转录因子OSX基因的表达 情况；相同浓度sr作用不同时间作用下BMP．7及OSX基因的表达情况。 2小时后再加入sr处理培养 3、加入BMP·7阻断剂noggin预处理BMSCs 细胞并用碱性磷酸酶标法、茜素红染色法、Western